NEWS

המחקר נערך בהובלת ד"ר מורן רובינשטיין והסטודנטית סג׳א פדילה, מבית הספר לרפואה ומבית ספר סגול למדעי המוח, וד"ר אריק קרמר, מאוניברסיטת מונפלייה בצרפת. עוד השתתפו במחקר: ענת מבשוב, מרינה ברוזל וקרן אנדרסון מבית הספר לרפואה ומבית הספר סגול למדעי המוח באוניברסיטת תל אביב, וחוקרים נוספים מצרפת, מארה"ב ומספרד. המאמר פורסם בכתב העת Journal of Clinical Investigation.

"תסמונת דרווה, ששכיחותה בערך אחת ל-16,000 לידות, נחשבת לנפוצה יחסית בין המחלות הגנטיות הנדירות. נכון להיום, חיים בישראל כ-75 ילדים הסובלים מדרווה. מדובר באפילפסיה התפתחותית קשה, שמתחילה בפרכוסי חום סביב גיל חצי שנה, ומתקדמת, לאחר גיל שנה, להתקפים אפילפטיים ספונטניים תכופים לצד עיכוב התפתחותי מוטורי וקוגניטיבי", מסבירה ד"ר רובינשטיין.

לדבריה, התרופות הקיימות לאפילפסיה אינן מסייעות במידה מספקת לילדים עם דרווה, והם מצויים בסיכון משמעותי למוות מוקדם. ידוע שהתסמונת הקשה נובעת ממוטציה גנטית שאינה עוברת בתורשה מההורים, אלא נוצרת באופן אקראי בעובר בגן שנקרא SCN1A. בנוסף, המחלה אינה מאפיינת מגזר מסוים באוכלוסייה, לא ניתן לצפות אותה מראש, וגם לא לגלותה במהלך ההיריון.

מה עושים כשקשה לבצע אבחון מוקדם?

לדברי החוקרים, כיום מקובל לבצע אנליזה גנטית לילדים שסובלים מפרכוסי חום מורכבים סביב גיל חצי שנה. "עם זאת, גם אם הבדיקה מזהה שהבעיה היא בגן SCN1A, האבחנה הסופית ניתנת לרוב לאחר החמרת האפילפסיה - הופעת פרכוסים ספונטניים קשים ועיכוב התפתחותי", הם אומרים.

בעיה נוספת שמעלים החוקרים היא כי "למרות שיש חשיבות רבה לאבחון המוקדם, לעיתים קרובות האבחנה מתעכבת, ולרוב הילדים מאובחנים רק בגיל שנה או שנתיים ולעיתים אף מאוחר יותר. טיפולים גנטיים שפותחו בעת האחרונה נמצאו יעילים בעכברים במודל לדרווה, וחלקם אף נמצאים כעת בשלב הניסויים הקליניים בבני אדם. אולם, טיפולים אלה הראו יעילות בעכברי מודל רק כאשר ניתנו בשלבים מוקדמים מאוד, עוד לפני הופעת התסמינים. מכיוון שטיפול גנטי הוא הליך מורכב ופולשני, הוא לא יינתן לילדים ללא אבחון ודאי. לכן במחקר זה, תוך התחשבות בגיל בזמן האבחנה הסופית, התרכזנו בפיתוח טיפול שיהיה יעיל לאחר הופעת הפרכוסים, ואף בגיל מאוחר יותר. בנוסף, מאחר שהתסמונת כוללת גם עיכוב התפתחותי, ביקשנו לפתח טיפול שיקל הן על האפילפסיה והן על התסמינים הקוגניטיביים".

"בטיפולים גנטיים נהוג להיעזר בנגיפים כנשאים המובילים חומר גנטי תקין לתוך גופו של החולה, על מנת שיתווסף ל-DNA הפגום ויאפשר פעילות תקינה. לצורך זה מהנדסים את הנגיף: מוציאים ממנו את החומר הגנטי המקורי שלו כדי שלא יוכל לגרום למחלה או לשכפל את עצמו, ובמקום זאת אורזים בתוכו את הגן התקין הרלוונטי. במקרה של תסמונת דרווה, מדובר בגן SCN1A שהוא גן גדול מאוד, ולכן ולא ניתן היה להשתמש בנגיפים נפוצים המשמשים בדרך כלל למטרה זו, והיה צורך בנגיף שמסוגל לשאת ולהעביר גנים גדולים. במחקר שלנו פתרנו את הבעיה על ידי שימוש בנגיף בשם Canine adeno virus type 2, כנשא של הגן התקין", מסבירה ד"ר רובינשטיין.

^{ד"ר מורן רובינשטיין}

תוצאות מבטיחות בניסוי המעבדה

במסגרת המחקר, טופלו עכברי מודל בנגיף הנושא גן SCN1A תקין, והטיפול נמצא יעיל במגוון היבטים קריטיים: שיפור באפילפסיה, הגנה ממוות מוקדם, ותיקון משמעותי של היכולות הקוגניטיביות.

בשלב הבא הזריקו החוקרים את הנגיף הנשא למספר אזורים במוחם של עכברי המודל על מנת שידביק את תאי העצב הפגועים. 31 עכברים טופלו בגיל 3 שבועות, לאחר הופעת הפרכוסים הספונטניים (מקביל לגיל שנה עד שנתיים אצל ילדים חולים), ו-13 עכברים טופלו בגיל 5 שבועות (מקביל בערך לגיל 6 עד 8 אצל ילדים). בנוסף, הוזרק נגיף ריק למוחם של 48 עכברים לצורך בקרה.

התוצאות היו מבטיחות. היעילות הגבוהה ביותר נצפתה בהזרקת הטיפול בגיל 3 שבועות. בעכברים אלה, הפרכוסים פסקו לחלוטין בתוך 60 שעות בלבד מההזרקה, תוחלת החיים עלתה משמעותית, והפגיעה הקוגניטיבית (שאובחנה באמצעות מבחני זיכרון מרחבי), תוקנה באופן מלא.

גם בעכברים שטופלו בגיל 5 שבועות נצפה שיפור משמעותי, שהתבטא בירידה בפעילות האפילפטית ובהגנה מפרכוסי חום. בעכברי קבוצת הביקורת שקיבלו נגיף ריק, לא נצפה כל שיפור והם סבלו מתסמיני המחלה ממש כמו עכברים שלא טופלו כלל, וכ-50% מהם מתו מוות מוקדם כתוצאה האפילפסיה הקשה. בנוסף הוזרק הטיפול לעכברים בריאים ולא גרם להם כל נזק – הוכחה לבטיחותו.

"הטיפול שלנו הוסיף לתאי העצב הפגועים במוח גן תקין, שהספיק בכדי להחזירם לתפקוד נורמלי. החזרת הגן התקין בשלמותו חשובה במיוחד בתסמונת דרווה, מכיוון שבילדים שונים המוטציה מתרחשת במקומות שונים בגן, והגן השלם מהווה טיפול יחיד המתאים לכל החולים. בנוסף, מצאנו שהנגיף שנבחר לצורך המחקר מדביק תאי עצב רבים במוח, ומתפזר באופן נרחב מעבר למקום ההזרקה״, מסבירים החוקרים.

"הטיפול שפיתחנו הוא הראשון שהוכח כיעיל עבור תסמונת דרווה כשהוא ניתן לאחר תחילת הפרכוסים הספונטניים, והראשון שהביא לשיפור בתפקוד הקוגניטיבי של עכברי המודל. רשמנו עליו פטנט, ואנחנו מקווים שבעתיד הוא יגיע לקליניקה ויסייע לילדים שסובלים מהמחלה הקשה. בנוסף, אנחנו בוחנים כעת אם הוא עשוי להתאים גם למחלות נוירו-התפתחותיות גנטיות אחרות. הפלטפורמה שפיתחנו היא פלטפורמת Plug & play לטיפולים גנטיים, ואולי בעתיד נוכל לארוז בנגיף הנשא גם חומר גנטי תקין מסוג אחר, לטיפול במחלות נוספות", מסכמת ד"ר רובינשטיין.

בעקבות הפיתוח הייחודי, צוות החוקרים מאוניברסיטת תל אביב הצליח כאמור לבודד ולזהות עשרות תכונות חדשות שהיו ממוסכות עד כה. פיתוח זה צפוי לחולל מהפכה בתהליכי ההשבחה של גידולים חקלאיים כיוון שהוא מתאים לשיפור של מרבית הגידולים ומרבית התכונות החקלאיות, כמו הגדלת יבול, עמידות ליובש או למזיקים. המחקר נערך בהובלת הפוסט-דוקטורנט, ד"ר יאנגז'ה הו, בהנחייתם של פרופ' אילון שני ופרופ' איתי מירוז מבית הספר למדעי הצמח ואבטחת מזון באוניברסיטת תל אביב. כמו כן, השתתפו במחקר חוקרים מצרפת, דנמרק, ושווייץ. המחקר פורסם בכתב העת היוקרתי Nature Plants. 

שימוש בטכנולוגיית הקריספר לעריכת גנים

פרופ' שני: "מזה אלפי שנים, מאז המהפכה החקלאית, נוהג האדם להשביח זנים של צמחים למטרות חקלאיות באמצעות יצירת שוֹנוּת גנטית. אך עד לפני מספר שנים לא ניתן היה להתערב באופן ממוקד בשינויים הגנטיים, אלא רק לזהות ולעודד תכונות רצויות שנוצרו באופן אקראי. התפתחות טכנולוגיות של עריכת גנים מאפשרות כיום לבצע שינויים מדויקים במספר רב של צמחים." 

במסגרת המחקר, צוות החוקרים נעזר בטכנולוגיה החדשנית 'קריספר' (CRISPR) לעריכת גנים ובשיטות מתחום הביו-אינפורמטיקה והגנטיקה המולקולרית כדי לפתח שיטה חדשה לאיתור גנים האחראים על תכונות ספציפיות בצמחים. 

החוקרים מסבירים שעל אף התפתחות הטכנולוגיה של עריכה גנטית, נותרו מספר אתגרים המגבילים את יישומה בחקלאות. אחד מהם הוא הצורך לזהות באופן מדויק ככל האפשר אילו גנים בגנום של הצמח אחראים על תכונה ספציפית שאנו מבקשים לטפח. השיטה המקובלת לעניין זה היא לייצר מוטציות, כלומר לשנות גנים בדרכים שונות, ואז לבחון את השינוי בצמח שנוצר מה-DNA המכיל את המוטציה, וללמוד מכך על פעילות הגן.  

כך, לדוגמה, אם מתפתח צמח בעל פירות מתוקים יותר, ניתן ללמוד מכך שהגן שעבר שינוי דרוש לקביעת מתיקות הפרי. שיטה זו נהוגה כבר עשרות שנים, וזוכה להצלחה מרובה, אולם יש בה גם בעיה מהותית: לצמח ממוצע כמו עגבנייה או אורז יש כ-30,000 גנים, אך כ-80% מהם אינם פועלים לבדם אלא מקובצים במשפחות של גנים דומים. לכן, אם פוגעים בגן יחיד ממשפחת גנים מסוימת, קיים סיכוי רב שגן אחר מאותה משפחה (למעשה עותק הדומה מאוד לגן הפגוע) ימסך על הפגיעה ויתפקד במקום הגן הפגוע. תופעה זאת, הקרויה יתירות גנטית, גורמת לכך שבסבירות גבוהה לא נצליח ליצור שינוי בצמח עצמו, ולא נצליח להבין את פעילות הגן וקישורו לתכונה ספציפית.  

צוות המחקר

שיפור השליטה במוטציות לצורך השבחה

המחקר הנוכחי ביקש למצוא פתרון לבעיית היתירות הגנטית בכלל הגנום, באמצעות שיטה חדשנית לעריכת גנים הקרויה 'קריספר'. מסביר פרופ' מירוז: "שיטת קריספר מבוססת על אנזים בשם Cas9 המצוי באופן טבעי בחיידקים, שתפקידו לחתוך רצפי DNA זרים. אל האנזים מצורף רצף מסוג sgRNA, שמזהה את רצף ה-DNA  אותו נדרש האנזים לחתוך. שיטת העריכה הגנטית מאפשרת לנו לתכנן רצפי sgRNA כרצוננו על מנת ש-Cas9 יחתוך כמעט כל גן שברצוננו לשנות. אנחנו ביקשנו ליישם את הטכניקה הזאת כדי לשפר את השליטה ביצירת מוטציות בצמחים למטרות השבחה חקלאית, וספציפית כדי להתגבר על הקושי שמציבה היתירות הגנטית." 

בשלב הראשון בוצע מחקר ביו-אינפורמטי במחשב, שבניגוד למרבית המחקרים בתחום כיסה מלכתחילה את הגנום השלם. החוקרים בחרו להתמקד בצמח ארבידופסיס (תודרנית לבנה) המשמש כצמח מודל במחקרים רבים ויש לו כ-30,000 גנים. ראשית הם ניפו כ-8,000 גנים בודדים, שאין להם בני משפחה, ולכן גם אין להם עותקים נוספים בגנום שיחפו עליהם. 22,000 הגנים שנותרו חולקו למשפחות, ועבור כל משפחה תוכננו באופן חישובי רצפי sgRNA מתאימים: כל רצף sgRNA נועד להוביל את אנזים החיתוך Cas9 אל רצף גנטי מסוים המאפיין את המשפחה כולה, במטרה ליצור מוטציות בכל חברי המשפחה, כך שלא יוכלו עוד לחפות זה על זה. כך נבנתה ספרייה שמנתה בסך הכול כ-59,000 רצפי sgRNA, המאפשרים פגיעה בו-זמנית ב-10-2 גנים בכל משפחת גנים, ובכך מנטרלים למעשה את תופעת היתירות הגנטית.  

לסדר את הגנים בספריות

בנוסף חולקו הרצפים ל-10 תת-ספריות בנות כ-6,000 רצפים כל אחת, על פי תפקידם המשוער של הגנים – גנים המקודדים לאנזימים, קולטנים, חלבוני שיעתוק, וכדומה. לדברי החוקרים, בניית הספריות היא כלי המאפשר למקד ולייעל את החיפוש אחר גנים האחראים לתכונות רצויות, חיפוש אשר עד כה היה אקראי במידה רבה.   

בשלב הבא עברו החוקרים מהמחשב למעבדה. כאן הם יצרו את כל 59,000 רצפי ה-sgRNA שזוהו בשיטה החישובית והנדסו אותם לתוך ספריות פלסמידים (דהיינו, מקטעי DNA מעגלי) חדשים בשילוב עם אנזים החיתוך. לאחר מכן יצרו החוקרים אלפי צמחים חדשים המכילים את הספריות - כאשר לכל צמח הוחדר רצףsgRNA יחיד המכוון נגד משפחת גנים ספציפית. 

החוקרים עקבו אחר התופעות שהתגלו בצמחים בעקבות השינויים בגנום, וכשנצפתה בצמח מסוים תכונה חדשה כלשהי, ניתן היה בקלות לדעת, על סמך רצף ה-sgRNA שהוחדר אליו, אילו גנים עברו שינוי. כמו כן, באמצעות ריצוף DNA של הגנים שזוהו, ניתן היה לברר מה מהות המוטציה שגרמה לשינוי ומה תרומתה לתכונות הצמח. בדרך זו מופו תכונות חדשות רבות שעד עכשיו היו ממוסכות בשל יתירות גנטית. באופן ספציפי זיהו החוקרים חלבונים ייחודיים המרכיבים מנגנון הקשור להובלת ההורמון ציטוקינין, שהוא חיוני להתפתחות התקינה של הצמח.  

פרופ' שני מסכם: "השיטה החדשה שפיתחנו צפויה לסייע רבות למחקר בסיסי להבנת מנגנונים בצמחים, אך מעבר לכך, יש לה משמעות עצומה לחקלאות: היא מאפשרת לחשוף באופן יעיל ומדויק את מאגר הגנים האחראים על תכונות שאנו מבקשים לשפר - כמו לדוגמה עמידות ליובש, למזיקים או למחלות, או הגדלת יבולים. אנחנו מאמינים שזהו עתידה של החקלאות: השבחת גידולים מבוקרת ומכוונת הפועלת בקנה מידה רחב היקף. כיום אנחנו מיישמים את השיטה שפיתחנו בהצלחה רבה על צמחי אורז ועגבנייה, ובעתיד אנו מתכוונים ליישם אותה גם על גידולים נוספים."   

לצורך זה הקימה חברת מיסחור הטכנולוגיות של אוניברסיטת תל-אביב (רמות), בשיתוף עם קבוצת אגכימדס (AgChimedes), את חברת DisTree. ההשקעה הכספית, בשילוב עם הליווי העסקי והמקצועי של אגכימדס, יאפשרו לDisTree ליישם את הטכנולוגיה החדשה במגוון גידולים, במטרה לחולל מהפכה בגנטיקה של עולם החקלאות, ולאפשר בטחון תזונתי בעידן של משבר האקלים.