השפעת המתכת הכבדה-קדמיום על מאזן המים
בצמח והדרך בה חודר אליו

על סמך המאמר:
Heavy metal toxicity: cadmium permeates through calcium channels
and disturbs the plant water status

Laetitia perfus-Barbeoch, Nathalie Leonhardt, Alain Vavasseur and Cyrille Forestier, 2002

עבודתה של יעל דניאל
במסגרת הקורס הוירטואלי: יחסי המים של צמחים, בהדרכתו של פרופ' עמרם אשל

רקע - מידע כללי על מתכות כבדות
רקע - מידע כללי על קדמיום
נושא המאמר ושאלת המחקר
תיאור השיטות והחומרים
תוצאות הניסויים
דיון בתוצאות
המשך מחקר
המכשירים בהם נעשה שימוש
פירוש מונחים שונים
ביבליוגרפיה



מתכות כבדות - מידע כללי

קבוצת המתכות הכבדות כוללת יסודות מתכתיים בעלי צפיפות הגבוהה יותר מ-5g/cm³.
אל קבוצה זו משתייכים יסודות רבים ביניהם: Ag, As, Cd, Co, Cu, Cr, Fe, Hg, Mn, Mo, Ni, No, Pb, Pt, Zn ורבים אחרים.
למתכות אלו יש מצבי חמצון וחיזור רבים והם יכולים להיות חלק ממרכיב הנמצא באנזימים שונים, למשל:
- Fe נמצא ב-heme
- Cu נמצאת בציטוכרום אוקסידאז, פלסטוציאנין וקטלאז.
- Zn מהווה מרכיב של דהידרוגנאזות וחלבונים הקושרים חומצות גרעין
- Mo קיים באנזימים שהם חלק מהמטבוליזם של חנקן, כמו, ניטרוגנאז וניטראט רדוקטאז
דוגמאות אלו מבטאות את הצורך המסוים של הצמחים במתכות הכבדות.
חלק מהמתכות הכבדות (25%) מהוות מיקרונוטריינטים (Fe, Mn, Zn, Cu, Ni, Mo, Co). אך למרביתם אין פונקציה מטבולית בצמח (Hg, Pb, Cd, Cr, As) והם רעילים לתא גם בריכוזים נמוכים. יחד עם זאת, בריכוזים גבוהים, גם מתכות שמהוות מיקרונוטריינטים הופכות להיות רעילות לתאים.
טווח הריכוזים המעיד על מחסור במתכות כבדות הוא צר ולא קשור למין הצמח. לעומת זאת, טווח הריכוזים המעיד על רעילות הנובעת ממתכות כבדות, הוא רחב מאוד ונובע מקיום של צמחים העמידים למתכות אלו עקב מנגנונים שונים של דהטוקסיפיקציה או הפחתה ביכולת קליטת המתכות.
במצב תקין, ריכוז המתכות הכבדות באדמה מספיקה להזנת הצמחים, אך עקב פעולות האדם (תעשייה, מכרות, מנועי מכוניות), הריכוז גדל בצורה משמעותית. זמינות היונים של המתכות הכבדות באדמה הוא הקריטי לצמח ולא הכמות הכללית שלהן. זמינות זו היא פונקציה של פוטנציאל הredox של האדמה, של pH, של הפעילות בשורש הצמח ושל מסיסות המתכות הכבדות כיונים או כתרכובות, שיחד יכולים לגרום למחסור בצמח או לרעילות יתר של מתכות כבדות בצמח.
מחסור של מתכות כבדות בצמח הוא בדרך כלל נדיר, בניגוד לעודף מתכות כבדות שמהווה מצב נפוץ יותר. הצמח מתמודד עם מחסור במתכות כבדות באמצעות שיפור יכולת הקליטה שלהם מהקרקע וזאת על ידי הגדלת שטח הפנים של השורשים והפרשה מוגברת של קלאטורים ופרוטונים, מתוך מטרה להעלות את ריכוז היונים באדמה. עודף מתכות כבדות באדמה הוא מצב כאמור נפוץ יותר עקב פעילות האדם והוא מהווה עקה משמעותית לצמח. בתגובה לעקה, צמחים רבים מפרישים מן השורש מעין טיפות אשר כולאות את המתכת הכבדה כתרכובת בלתי מסיסה באדמה ובאחרים יש קישור של המתכת לאוליגו או לפוליפפטידים בציטוזול (ובכך יש הפחתה שלהם בתאים). Methallothioneins ו-phytochelatins, הם שני סוגים של פוליפפטידים, אשר קושרים לשיירי הציסטאין שלהם יונים של מתכות כבדות. בנוסף, דהנטורציה של חלבונים הנגרמת על ידי עודף יונים של מתכות כבדות, גוררת הפעלה והצטברות של צ'פרונים.
הן מחסור במתכות כבדות והן הרעילות שלהם גורמות לכלורוזה, שמקורה יכול להיות משתי מצבים אלו. כלורוזה הנובעת מרעילות נגרמת כתוצאה מהלבנה של הפיגמנטים הפוטוסינטטיים על ידי (ROS (reactive oxygen species. כלורוזה הנובעת ממחסור של מתכות נגרמת כתוצאה מהעדר תהליך הביוסינטזה של כלורופיל עקב מחסור בקופקטורים.
המתכות הכבדות שאינן נחוצות לצמח נכנסות אליו דרך טרנספורטרים של מתכות אחרות אשר נחוצות לצמח. מאחר ומרבית המתכות הכבדות רעילות לצמח, אין לצמח טרנספורטרים ייחודיים עבורן ולכן הן נכנסות דרך טרנספורטרים אחרים, בעלי סלקטיביות לא מושלמת. חוסר הסלקטיביות נובע מדמיון מבני בין מתכות דומות, (כמו רדיוס יוני דומה).
צמחים המסוגלים לאגור בתוכם ריכוזים גבוהים יחסית של מתכות כבדות מהאדמה נקראים metallophytes ורובם ממשפחת המצליבים. ב-phytoremediation, עושים שימוש בצמחים אלו מתוך מטרה לנקות אדמה מזוהמת מן המתכות הכבדות. הצמחים גדלים על האדמות המזוהמות ולאחר שהם מגיעים לבגרות וצוברים בתוכם מקסימום ריכוז של מתכות, הם בדרך כלל מתים ומסולקים מהשטח.
כיום נעשה שימוש במספר מינים של צמחים, אשר מסוגלים לגדול על אדמות מזוהמות במתכות כבדות ולצבור אותם בתוכם.

Alpine pennycress- צמח זה מסוגל לקלוט את המתכות הכבדות אבץ וקדמיום כאשר הן נמצאות בעודף באדמה מזוהמת

Thlaspi arvense - העלים של צמח זה מסוגלים לקלוט כמות גדולה של אבץ וקדמיום מאשר צמחים אחרים, הודות לגנים שמווסתים את כמות המתכת הנקלטת. המתכות נקלטות על ידי השורשים באדמה ומועברות לאתרים אחרים בצמח.

מקורות

.Schulze.E.-D, Beck.E, K.Muller-Hohenstein. (2005) Plant Ecology, pp182-194
קורס בפיזיולוגיה של הצמח, שנה ב'

בחזרה לראשית

קדמיום - מידע כללי

מאפיינים כימיים
קדמיום (Cadmium) הוא יסוד כימי מתכתי טבעי, ממשפחת מתכות המעבר שסימולו הכימי הוא Cd ומספרו האטומי הוא 48. זוהי מתכת רכה וגמישה, בעלת דרגת חימצון נפוצה 2+. דרגת החימצון 1+ קיימת, אך היא נדירה יותר.

נתונים כימיים עבור קדמיום

סמל כימי	Cd
מספר אטומי	48
סידרה כימית	מתכות מעבר
מצב צבירה בטמפ' החדר	מוצק
משקל אטומי amu	112.441
צפיפות Kg/m3	8650
טמפרטורת התכה	321.07°C
טמפרטורת רתיחה	767°C
אלקטרושליליות	1.69
קיבולת חום סגולי J/Kg*K	233

שימוש ותפוצה
המתכת התגלתה בשנת 1817 כתוצר לוואי של תהליך הפקת האבץ, אך השימוש הנרחב בו החל רק ב-50 השנים האחרונות. לקדמיום יש שימושים תעשייתיים רבים שביניהם: מרכיב של סוללות (75%), ציפוי וייצוב פלסטיק, מיגון בכורים גרעיניים מפני קרינה, ציפוי לוחות פלדה, נחושת ומתכות אחרות במטרה לחזקן. מחצבי הקדמיום הם נדירים ונמצאים בדרך כלל בכמויות קטנות. CdS הוא מינראל הקדמיום, שבדרך כלל מופיע עם אבץ גופרית (ZnS). לכן, קדמיום מופק כתוצר לוואי של כרייה, זיקוק ועיבוד אבץ גופרית.
קדמיום הינה מתכת כבדה שאיננה חיונית לצמח ומהווה מזהם סביבתי כתוצאה מפעילויות חקלאיות, מכרייה, מתעשייה ומגזים הנפלטים מאמצעי התחבורה. בשנה, משוחררת כמות עצומה של קדמיום לסביבה וערכה מגיע ל כ-25 אלף טון. חצי מכמות זו משוחרר לנהרות עקב חשיפת סלעים לאוויר וחלק קטן יותר משוחרר לאוויר עקב שריפת יערות וולקנו. השאר משוחרר לסביבה באמצעות פעולות האדם וכמותו באדמה רבה שכן נמצא בדשנים ובקוטלי מזיקים. מאחר ולמתכת יש אפקט רעילות גבוה וכן יכולת מסיסות גבוהה במים הוא נפוץ בעיקר באקוסיסטמיות מימיות.

קליטה והובלה בצמח
פקטורים רבים באדמה משפיעים על יכולת הצמח לקלוט את המתכות הכבדות, כאשר עבור קדמיום יכולת הצמח גדלה ככל שה- pH יורד. כמו כן, נראה כי נוכחות של קלטורים או אבץ במדיום, משפרת את יכולת הקליטה של קדמיום.
מעבר הקדמיום מהשורש לנצר מתקיים לאחר חשיפה ממושכת למתכת ויכול לנבוע ממעבר אקטיבי, העדר של קלטורים פעילים בשורש או מעבר דרך מסלול הטרנספורט של מתכות כמו: Zn, Mn, Ca, אך עדיין ריכוזו בשורשים הרבה יותר גבוה מריכוזו בנצר.

רעילות
רעילות הקדמיום גבוהה הן לצמחים והן לבעלי חיים, כולל האדם, גם בריכוזים נמוכים. אורגניזמים ימיים רוכשים את המתכת ישירות דרך מקורות מים מזוהמים או דרך שרשרת המזון. צמח הינקינטון מהווה ביואינדיקטור למדד זיהום המים על ידי מתכות כבדות, ביניהם הקדמיום.
רעילות בצמחים הנובעת מקדמיום גורמת לנבילה ולכלורוזה. הכלורוזה נובעת מיכולתו של קדמיום להיקשר בצורה ישירה או בלתי ישירה עם ברזל ובכך להוריד את ריכוזו החופשי בתא. בנוסף ליכולת זו, הקדמיום יכול לפגוע בקליטה, בטרנספורט ובניצול של המתכות: Ca, Mg, P, & K ושל המים. במין הצמח duckweed הרעילות הייתה בלתי תלויה בטמפרטורה, בעוד שבמינים אחרים נצפתה ירידה ברעילות כתלות בטמפרטורה.
כמו כן, לקדמיום יש יכולת לפגוע באופן דומה בתהליכים ביולוגיים המשלבים מתכות אחרות כמו: מגנזיום וסידן. מספר מאמרים הראו כי חשיפה לקדמיום גורמת לנזקים פיזיולוגים וגנטיים, ביניהם אברציות כרומוזומאליות ועיכוב בחלוקת התאים.
לאבץ וקדמיום יש תכונות פיזיקליות וכימיות רבות. לכן, מנגנון האינטראקציה של שתי מתכות אלו במערכת ביולוגית הוא דומה ומסיבה זו יש ביניהם תחרות על קישור לליגנדים רבים.
אחת הסיבות לרעילות המתכת היא קישורה לאנזימים הקושרים אבץ לתפקודם, במקום האבץ. למרות שלקדמיום ואבץ יש דמיון בחלק מהתכונות הכימיות, העדר האבץ פוגם בתפקוד תקין של האנזים. העובדה שקדמיום הינה מתכת כבדה שרעילה לצמח ואבץ הינו אלמנט חיוני לצמח, מעלה את האפשרות למניעת האפקט הטוקסי של קדמיום באמצעות טיפול באבץ.

עמידות צמחים לעודף קדמיום
עמידות צמחים למתכות כבדות היא עניין לאקולוגים ופיזיולוגים רבים ומהווה דרך משמעותית להפחתת האפקט הרעיל של מתכות אלו, עקב חשיפה מוגברת.
למיני צמחים עמידים יש טווח רחב של עמידות לעודף קדמיום במדיום הגידול. מינים אלו חייבים להיות מסוגלים למנוע את הקליטה של עודף הקדמיום או לגרום לדהטוקסיפיקציה שלו לאחר שנקלט. קיימים מנגנונים שונים של עמידות בצמחים וזאת כתלות בסביבה המזוהמת בה הם גדלים.
במיני צמחים רבים ואף במספר מיקרואורגניזמים קיימים חלבונים קושרי קדמיום, methallothioneins, אשר עשירים בשיירי ציסטאין הקושרים את המתכת. בצמחים עילאיים כמו טבק, אורז, עגבנייה קיימים קומפלקסים קושרי קדמיום, אשר דומים ל- methallothioneins ונמצאים בעיקר ברקמת השורש.
מחקרים רבים מנסים לאפיין את האפקטים השונים של קדמיום על מיני צמחים רבים, מתוך מטרה להבין את השפעותיו על הצמח ואת המנגנונים העומדים מאחוריהם. המאמר שבו עוסקת העבודה (Perfus-Barbeoch L., et al. 2002), בוחן את השפעת המתכת הכבדה Cd (קדמיום) על אספקטים שונים במאזן המים של שלושה סוגי צמחים והדרך שבאמצעותה חודר הקדמיום לצמח.

מקורות

מידע כללי
מידע כללי מויקיפדיה
Das,p., Samantaray, S., Rout R. (1997) Studies on cadmium toxicity in plants: A review. Environmental pollution.98, 29-36.

בחזרה לראשית

נושא המאמר ושאלת המחקר
קדמיום הינה מתכת כבדה הרעילה לצמח וכמותה באדמה גוברת בעקבות פעילות האדם. כניסת יוני קדמיום מהאדמה לשורש הצמח יכולה להתבצע דרך הטרנספורטרים של מתכות אחרות כמו של ברזל – IRT1 ושל אבץ ZNT1 .
(Korshunova et al., 1999; Cohen et al., 1998; Lasat et al., 2000)
חשיפה ממושכת של הצמח למתכת קדמיום מעכבת את גידול הצמח, באמצעות השפעה על אספקטים פיזיולוגים רבים, המעורבים בהתפתחות הצמח, למשל: קורלציה לינארית חיובית בין ריכוז הקדמיום לעיכוב תהליכי הפוטוסינתזה והטרנספירציה (Bazzaz et al., 1974).
ירידה באסימילציה של CO2 וירידה נוספת ביעילות הקוונטית המקסימאלית (Greger and Ogren, 1991), עקה אוקסידטיבית ועיכוב בהתארכות השורש (Schutzendubel et al., 2001), הפרעה ביחסי המים בצמח וקמילה (Barcelo and Poschenrieder., 1990).
מחקרים אחרים מראים שבתגובה לקדמיום מתרחשת בצמח תגובה של דהטוקסיפיקציה שכוללת: יצירה של פיטוקלטינים, העשירים בשיירי ציסטאין שבאמצעותם קושרים את יוני המתכות הכבדות אליהם (Grill et al., 1987), עלייה בביטוי האנזים גמא גלוטמיל סינטטאז, המהווה אנזים מרכזי בביוסינטזה של גלוטטיון (Haag-Kerwer et al., 1999) וכן מעבר של יוני קדמיום ופפטידים הקשורים לקדמיום למרכיבי תא שונים כמו הוקואולה (Vogeli and Wagner, 1990).
בניגוד להשפעות פיזיולוגיות שונות של קדמיום על הצמח, אשר תוארו וקיימת עליהם הסכמה בקרב הקהילה המדעית, ההשפעה של קדמיום בעיכוב הפוטוסינטזה ובהפרעה למאזן המים בצמח ברמת הנצר, היא עדיין בגדר ויכוח וזאת עקב מחקרים שונים אשר בדקו את השפעת המתכת על הפרמטרים הנ"ל ומציגים תוצאות מנוגדות (Baryla et al.,2001; Haag-Kerwer et al., 1999).
מטרת מאמר זה היא לבדוק את הקשר בין קדמיום לאספקטים שונים הקשורים למאזן המים בצמח. לכן, נבדקה השפעת קדמיום על מוליכות העלה, חילוף הגזים , שלמות המערכת הפוטוסינטטית ואפקט של סגירת הפיוניות. בנוסף, על מנת להבין האם יש קשר בין עקת מים ליכולת של קדמיום לגרום לסגירת הפיוניות, נערכה השוואה בין האפקט של קדמיום בצמחי בר לבין צמחים מוטנטים אשר אינם רגישים להורמון ABA . אספקט נוסף של קדמיום נחקר גם כן במאמר זה. מאחר ומחקרים שונים הציגו עובדות המצביעות על יכולת חדירה של קדמיום דרך תעלות סידן ( White, 2000), נבדקה יכולת החדירה של המתכת דרך תעלות הסידן של תאי הסגירה.

מקורות

Baryla, A., Carrier, P., Franck, F., Coulomb, C., Sahut, C. and Havaux, M. (2001) Leaf chlorosis in oilseed rape plants (Brassica napus) grown on cadmium-polluted soil: causes and consequences for photosynthesis and growth. Planta, 212, 696–709

Bazzaz, F.A., Rolfe, G.L. and Carlson, R.W. (1974) Effect of Cd 2+ on photosynthesis and transpiration in excised leaves of corn and sunflower. Plant Physiol. 32, 373–376

Cohen, C.K., Fox, T.C., Garvin, D.F. and Kochian, L.V. (1998) The role of iron-deficiency stress responses in stimulating heavy-metal transport in plants. Plant Physiol. 116, 1063–1072

Greger, M. and ogren, E. (1991) Direct and indirect effects of Cd 2+ on photosynthesis in sugar beet (Beta vulgaris). Physiol. Plant. 83, 129–135

Grill, E., Winnacker, E.L. and Zenk, M.H. (1987) Phytochelatins, a class of heavy-metal binding peptides from plants are functionally analogous to methallothioneins. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 84, 439–443

Haag-Kerwer, A., Schafer, H.J., Heiss, S., Walter, C. and Rausch, T. (1999) Cadmium exposure in Brassica juncea causes a decline in transpiration rate and leaf expansion without effect on photosynthesis. J. Exp. Bot. 341, 1827–1835

Korshunova, Y.O., Eide, D., Clark, W.G., Guerinot, M.L. and Pakrasi, H.B. (1999) The IRT1 protein from Arabidopsis thaliana is a metal transporter with a broad substrate range. Plant Mol Biol. 40, 37–44

Lasat, M.M., Pence, N.S., Garvin, D.F., Ebbs, S.D.and Kochian, L.V. (2000) Molecular physiology of zinc transport in the Zn hyperaccumulator Thlaspi caerulescens. J. Exp Bot. 342, 71–79

Schutzendubel, A., Schanz, P., Teichmann,T., Gross, K., Langenfeld-Heyser, R., Godbold, D. and Polle, A. (2001) Cadmium-induced changes in antioxidative systems, hydrogen peroxide content, and differentiation in scots pine roots. Plant Physiol. 127, 887–898

Vogeli-Lange, R. and Wagner, G.J. (1990) Subcellular localization of cadmium-binding peptides in tobacco leaves. Implications of a transport function for cadmium-binding peptides. Plant Physiol. 92, 1086–1096

White,P. (2000) Calcium channels in higher plants. BBA Acta, 1465, 171–189

בחזרה לראשית

תיאור השיטות והחומרים בהם השתמשו במאמר

א. הצמחים בהם נעשה שימוש
ב. תנאי הגידול של הצמחים
ג. טיפולי קדמיום ומדידת ריכוזו בצמח
ד. מדידת RWC
ה. מדידת חילוף הגזים בצמח
ו. Epidermal bioassay
ז. Chlorophyll fluorescence
ח. Patch-clamp experiment

הערה: פרט למידע המצוי במאמר, קיימים נושאים המסתמכים על אינפורמציה נוספת. אינפורמציה זו מפורטת תחת כותרת מקורות.

א. הצמחים בהם נעשה שימוש
מאפיינים סיסטמטיים של הצמחים שנחקרו במאמר:

	Arabidopsis thaliana	Vicia faba	Commelina communis
שם הסוג	Arabidopsis	Vicia	Commelina
שם המין	thaliana	faba	communis
שם הצמח בעברית	תודרנית לבנה	ביקיית הגינה	אין שם עברי
משפחה	BRASSICACEAE מצליבים	FABACEAE פרפרניים	COMMELINACEAE קומליניים

Arabidopsis thaliana

הצמח Arabidopsis thaliana, או כפי שקרוי בעברית 'תודרנית לבנה', הינו צמח בעל פרחים ממשפחת המצליבים, שמקורו באירופה. זהו הצמח הנחקר ביותר בביולוגיה ההתפתחותית, המולקולארית והביוכימית ומהווה אורגניזם מודל. התודרנית הלבנה משתייכת לקבוצת הדו פסיגים והינה צמח חד שנתי. אזורי הגידול שלה משתרעים מהקוטב הצפוני ועד קו המשווה, כאשר בארץ ניתן למצוא אותו באזור הר החרמון. גובהו נע בין 35-40 ס"מ.

לצמח אין חשיבות חקלאית אך תכונות רבות שקיימות בו מקנות לו יתרונות רבים, שבזכותם נוח וקל לעבוד עימו במחקרים גנטיים: מחזור הנביטה של התודרנית קצר מאוד ואורך כ-6-8 שבועות מנביטה ועד זרע בוגר. כמו כן, ניתן בקלות להצליב בין זנים שונים של הצמח בכדי לחקור דפוסי תורשה של גנים.
לצמח גנום קטן, שגודלו כ-125 נוקלאוטידים ומתפרש על פני 5 כרומוזומים. הגנום רוצף במלואו בשנת 2000 והיה הגנום הצמחי הראשון שרוצף. כיום 25,500 גנים רוצפו ומעריכים שהוא כולל 26,000 גנים, בדומה לגנום האדם. תכונות נוספות כמו היותו קטן, קל לגידול, יכולת הכלאה עצמית ויעילות גבוהה של טרנספורמציה באמצעות אגרובקטריום, מעניקות לצמח יתרונות נוספים לשימושו במחקר.
פריחת התודרנית מתרחשת באפריל-מאי וצבעה לבן. הפרחים קטנים, מושלמים (כלומר מכילים אברים נקביים וזכריים) ומורכבים מ-4 עלי כותרת, 4 עלי גביע, 6 אבקנים ו-2 עלי שחלה מאוחים זה לזה. התודרנית הלבנה היא אחת משתי מערכות בהן נחקרה הביולוגיה המולקולארית של התפתחות הפריחה. המערכת השנייה היא Antirrhinum majus.
במאמר זה נעשה שימוש באקוטיפ Landsberg erecta, של ארבידופסיס.
ההיסטוריה של קו זה מתחילה ב-George Redei, שקיבל מלאי של זרעים עם השם Landsberg, אותם הקרין בקרני X לטובת ניסויי מוטגנזה. במהלך הניסויים התברר כי המלאי המקורי לא היה הומוגני, אלא מהווה תערובת של סוגי זרעים שונים.
הקו Landsberg erecta הוא חלק מאוכלוסיית Landsberg שהוקרנה. הקו נקרא כך על ידי Will Feenstra והיווה הקו שממנו יוצרו כל המוטנטים על ידי Feenstra, Van der Veen and Koornneef מאוניברסיטת Wageningen. מהסיבה הזו, הקו Landsberg המקורי נחשב כ- La-0 בעוד שLandsberg erecta שהוגדר על ידי Will Feenstra וממנו יצרו מוטנטים שונים נחשב רקע נפרד – Ler-0.
הקו Landsberg erecta מאופיין כבעל שיעור קומה נמוך, בעל פריחה מוקדמת, כאשר התפרחת הבוגרת קצרה.
פרט לקו זה קיימים עוד שני קווים: Columbia ו- Wassilewskija. כולם יכולים להיות מוזמנים ממרכז המלאי האירופאי של ארבידופסיס .

Landsberg erecta

מקורות

מידע כללי מויקיפדיה
Arabidopsis: The Model Plant
The Arabidopsis Information Resource
The European Arabidopsis Stock Centre

Vicia faba

הצמח Vicia faba, או כפי שקרוי בעברית 'ביקיית הגינה' (פול), הינו שיח בעל פרחים ממשפחת הפרפרניים. צמח זה נחקר רבות במחקרים אלקטרופיזיולוגיים הנוגעים לתאי השמירה של הפיוניות. הוא משתייך לקבוצת הדו פסיגים והינו צמח חד שנתי. מקור הטבעי של הצמח הוא בצפון אפריקה ובדרום אסיה אך קיימים זנים תרבותיים שלו בכל מקום בעולם. גובהו נע בין 0.5-1.7 מטר. הצמח גבוה, חזק, מסועף ובעל גבעול מרובע. הפרחים גדולים וצבעם לבן עם נקודות סגולות. הפרי הוא תרמיל ירוק ובו מצויים 3-8 זרעים. התקופה הטובה ביותר לגידולו היא בעונה קרה. Vicia faba הוא צמח דיפלואידי, בעל 12 כרומוזומים (6 זוגות כרומוזומים הומולוגים).

מקורות

מידע כללי מויקיפדיה
Botanical on-line

Commelina communis

הצמח Commelina comunis הוא צמח רב שנתי, בעל פרחים, המשתייך למשפחת הקומליניים ולקבוצת החד פסיגיים. מקור הצמח הוא מאסיה וניתן למצוא אותו בצידי דרכים ובמקומות נטושים ושוממים (בעיקר באדמות יבשות או לחות). גובהו נע בין 30-90 ס"מ. הצמח גדל ומתפשט במהירות, דבר המהווה חיסרון, שכן נוצרת תחרות בין הצמחים על שטח פנוי, מים ונוטריינטים.
זמן הפריחה של הצמח הוא בחודשי יוני – אוקטובר, כאשר צבע הפרחים הוא כחול. כל פרח פורח במשך יום אחד בלבד. הפרח מורכב מ-2 עלי כותרת גדולים כחולים ועלה כותרת בודד קטן יותר, שצבעו לבן ובנוסף, מכיל אברים זכריים ונקביים. פרי הצמח הוא הלקט אשר מכיל 1-2 זרעים חומים.
הצמח נחקר רבות בגישות ביוכימיות, הודות לקלות מיצוי הפרוטופלסט מתאי פיוניות. ניסויים פרמקולוגיים גם כן משתמשים בצמח זה מאחר וקל למדוד את חרירי הפיונית בקליפה אפידרמאלית.

מקורות

Hilton Pond Center
מידע כללי

Abscisic acid insensitive mutant of A.thaliana

במאמר שפורסם ב-1984, בודדו ואופיינו 5 מוטנטים בתודרנית לבנה, מ-3 לוקוסים שונים, אשר אינם רגישים להורמון ABA.
במוטנטים אלו נצפו מאפיינים של העדר של תרדמה בזרעים ופנוטיפ של נבילה המצביע על הפרעה במאזן המים. מאפיינים אלו תאמו את שנצפה במוטנטים בעלי מחסור בהורמון(ABA deficient mutants). לעומת זאת, במוטנטים אלו תוספת של ABA אקסוגני למוטנטים לא שחזרה את פנוטיפ הבר וזאת בניגוד למוטנטים בעלי מחסור בהורמון. בנוסף, בכל המוטנטים נצפתה רמה דומה או גבוהה יותר של ABA אנדוגני, בהשוואה לwild type, הן בזרעים והן בפירות.
בשנות ה-90 זוהו תוצרי הגנים עבור שלושת הלוקוסים (abi1-3) וכן עבור לוקוס נוסף (abi4):
- abi1 ו- abi2 מקודדים לפוספטאזות (protein phosphatases)
- abi3 ו-abi4 מקודדים לפקטורי שעתוק (transcription factors)
abi1-1
במאמר, נשאלת השאלה האם האפקט של סגירת הפיוניות על ידי יוני קדמיום נובע מעקת מים ובפרט נגרם ממסלול התלוי ב-ABA. על מנת לענות על התשובה נבדקה השפעת המתכת על מוטנט זה.
הגן TAIR accession AT4G26080.1) ABI1), מצוי על גבי כרומוזום מספר 4 בגנום התודרנית הלבנה ומורכב מ2054 נוקלאוטידים המשועתקים ומתורגמים לחלבון, אשר מכיל 435 חומצות אמינו. הגן במצב תקין מקודד לחלבון פוספטאז (protein phosphatase type 2C), שפעילותו היא בקטליזת הריאקציה בה מתבצעת הורדת הפוספאט מחלבון הקשור לפוספאט: Phosphoprotein + H2O = protein + phosphate המוטנט abi1-1, הינו מוטנט דומיננטי, אשר מפגין חוסר רגישות להורמון ABA וכן חסר את הפעילות הקטליטית של החלבון phosphatase type 2C.
להלן תיאור הפנוטיפים השונים שנצפו עבור המוטנט ותוארו ב-TAIR:
- עמידות להורמון ABA
- רגישות המוטנט לעיכוב הנביטה על ידיABA יורדת
- רמת ה-ABA האנדוגני עולה במהלך התפתחות הזרע
- מאזן המים של המוטנט משובש
- קצב הטרנספירציה בעלה עולה, דבר המוביל לנבילת המוטנט בעיקר בתנאים של עקת מים ולחות נמוכה
- תרדמת הזרעים מופחתת ולכן זרעים חדשים נובטים בתדירות גבוה
-רגישות נמוכה לתהליך הביוסינתזה של מעכבים ל-GA (כמו paclobutrazol)
- רגישות נמוכה לעקת מלח ולעקה אוסמוטית במהלך הנביטה

מקורות

The Arabidopsis Information Resource

Koornneef, M., Reuling, G. and Karssen, C.M. (1984) The isolation and characterization of abscisic acid-insensitive mutants of Arabidopsis thaliana. Physiol. Plant. 61, 377–383.

Hoth, S., Morgante, M., Sanchez, J.P., Hanafey, M., Tingey, S., and Chua, N.-H. (2002). Genome-wide gene expression profiling in Arabidopsis thaliana reveals new targets of abscisic acid and largely impaired gene regulation in the abi1–1 mutant. J. Cell Sci. 115, 4891–4900.

בחזרה לראש הפרק

ב. תנאי הגידול של הצמחים
צמחי Vicia faba גודלו בעציצים, המכילים יחס של 3:1 בין זבל אורגאני למינראל זכוכית perlite והועברו לתאי גידול (=growth chambers). בתאי הגידול נחשפו הצמחים ל-8 שעות אור בעוצמה של 300 µmol/m2s, טמפרטורה של 21°C ו-70% לחות יחסית.
צמחי Commelina communis גודלו בעציצים המכילים אדמת חול גס וHoagland's Nutrient Solution מהולה פי 2. העציצים הועברו לתאי גידול שם נחשפו הצמחים ל-14 שעות אור בעוצמה של 250 µmol/m2s, טמפרטורה של 25°C ו-60% לחות יחסית ו-10 שעות חושך בטמפרטורה של 20°C ו-80% לחות יחסית.
צמחי Arabidopsis thaliana גודלו בעציצים שגודלם: 65,65, 70מ"מ, המכילים אדמת חול עם Hoagland's Nutrient Solution מהולה פי 2. העציצים הועברו לתאי גידול, שם נחשפו הצמחים ל-8 שעות אור בעוצמה של 250 µmol/m2s ובטמפרטורה של 22°C ו-16 שעות חושך בטמפרטורה של 20°C, במצב של 70% לחות יחסית.

מקורות

Leonhardt, N., Marin, E., Vavasseur, A. and Forestier, C. (1997) Evidence for the existence of a sulfonylurea-receptor-like protein in plants: modulation of stomatal movements and guard cell potassium channels by sulfonylureas and potassium channel openers. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 94, 14156–14161

Leymarie, J., Lasceve, G. and Vavasseur, A. (1998) Elevated CO2 enhances stomatal responses to osmotic stress and ABA in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Envir. 22, 301–308

Vavasseur A, Lasceve G, Cousson A (1995) Guard cell responses to potassium ferricyanide Physiol Plant 93: 253-258

בחזרה לראש הפרק

ג. טיפולי קדמיום ומדידת ריכוזו בצמח
טיפולי הקדמיום, במצבים בהם טיפוח הצמחים נעשה בתמיסת נוטריינטים (הידרופוניקה), יושמו על צמחים שגילם 2-3 שבועות ונבחרו בצורה אחידה. תנאי הגידול שלהם פורטו בסעיף א. תמיסת הנוטריינטים בה השתמשו בניסוי הייתה Hoagland's Nutrient Solution כשהיא מהולה פי 2. התמיסה כל הזמן אווררה והוחלפה כל יום שני בניסוי.
על מנת למדוד את הצטברות הקדמיום בצמחי התודרנית, בתום הטיפול נאספו דוגמאות מן הנצר והשורש והועברו לתמיסת נוטריינטים חסרת קדמיום. בהמשך, יובשו הדוגמאות בתנור למשך 48 שעות ולבסוף הוסף HNO3 מרוכז, במשך 90 דקות וב-160°C לטובת יצירה של תמצית. האנליזה של ריכוז הקדמיום בתמיסה נעשתה באמצעות המכשיר (flame atomic absorption spectrophotometer (Perkin Elmer 4100.

בחזרה לראש הפרק

ד. מדידת RWC
חישוב RWC נעשה עבור דגימות של רקמות עלים מהצמחים, ששטחם נע בין 5-10cm². הרקמות הועברו לצלוחיות ונשקל משקלן הטרי (FW). בהמשך, הרקמה צפה במים במשך 4 שעות תחת תנאי אור וטמפרטורת החדר ובסיומן נשקלה שוב הרקמה במצב בו הטורגור מלא (TW). לאחר ניגוב שאריות מים ולחות מהרקמה היא הועברה לתנור בו הטמפרטורה היא 85°C לתקופה של 24 שעות. בתום השהייה בתנור הרקמה קוררה מעט וחושב משקלה היבש (DW). חישוב RWC נעשה לפי הנוסחא הבאה: RWC% = (FW-DW)/(TW-DW)x 100

מקורות

Smart, R.E., Bingham, G.E. (1974) Rapid estimates of relative water content. plant physiol. 53, 258-260

בחזרה לראש הפרק

ה. חילוף הגזים בצמח
צמחי תודרנית לבנה בני ארבע שבועות הועברו למתקן ניסוי המורכב משני תאים בלתי תלויים, האחד תא לשורש והשני תא לנצר. הטמפרטורה בתאים היא 20°C והלחות היחסית היא 3 +/- 70% . לחץ אדי המים בכניסה וביציאה של תא הנצר נמדדו באופן רציף באמצעות dew point hygrometer. הלחץ החלקי של CO2 משני צידי המתקן (כניסה ויציאה) נמדד באמצעות המכשיר differential infrared gas analyzer. טמפרטורת העלה נמדדה באמצעות thermistor probe, שהודבק לצידו התחתון של העלה, באמצעות דבק דו צדדי דק.
כל הנתונים נאספו ונרשמו במחשב, באמצעות תוכנת Labview. פני שטח העלה נמדד יומיומית מתוך תצלומים מוגדלים.
קדמיום כלוריד (CdCl2) הועבר לתמיסת הנוטריינטים המאווררת לאחר שעה מזמן הארת הצמח. בנוסף, תמיסת הנוטריינטים הוחלפה מידי יום.

מקורות

Leymarie, J., Vavasseur, A. and Lasceve, G. (1998) CO2 sensing in stomata of abi1-1 and abi2-1 mutants of Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. Biochem. 36, 539–543.

בחזרה לראש הפרק

ו. Epidermal bioassay
עליהם של שלושת הצמחים: A.thaliana, C.communis, V.faba, נאספו בסוף תקופת הלילה ומהאפידרמיס התחתון של עליהם הוכנו רצועות אפידרמאליות בגודל של 5mm x 5mm. לאחר שהרצועות האפידרמאליות קולפו, הן הועברו לתמיסת אינקובציה שם הן צפו כשהצד העליון של העלה היה כלפי מעלה. תמיסות האינקובציה עבור שלושת הצמחים היו כדיקלמן:
A.thaliana – 10mM MES, pH 6.2 & 10mM KCl + 7.5mM K⁺²-iminodiacetate
C.communis - 10mM MES, pH 6.2 & 50Mm KCl
V.faba - 10mM MES, pH 6.2 & 30mM KCl + 1mM CaCl2
*MES =methyl ethylene sulfate (מתיל אתילן סולפאט).
השהייה הראשונית בתמיסת האינקובציה הייתה למשך 30 דקות בחושך וזאת לטובת סטנדרטיזציה של המצב הראשוני. בהמשך, המעכבים של תעלות הסידן הוספו חצי שעה לפני הוספת הקדמיום והאינקובציה הייתה בחושך או באור בטמפרטורה של 25 מעלות. לאחר הוספת הקדמיום ואינקובציה של שעתיים וחצי, פתחי הפיונית נצפו ונמדדו מבעד למיקרוסקופ אופטי המצויד במצלמה, digitizing table ובמחשב.
בכל טיפול נמדדו 60 פתחי פיוניות בפחות מ-5 דקות והנתונים המוצגים מייצגים את הממוצע. לכל ניסוי בוצעו 3 חזרות. הערך הסטטיסטי SEM נתון עם רמת ביטחון של 95%. בחלק מהניסויים, הרצועות האפידרמאליות הוכנו מהצמח כבר בphytotron והועברו מיידית להסתכלות מבעד למיקרוסקופ.

בחזרה לראש הפרק

ז. Chlorophyll fluorescence
פלורוסנציית הכלורופיל של הצמחים, נמדדה בתום תקופת החושך באמצעות המכשיר pulse amplitude modulation fluorometer. אספקת האור הגיעה מסיב אופטי אשר נשמר צמוד לעלה במרחק וזווית קבועה. עוצמת האור נמדדה ברמת העלה באמצעות quantum meter. הפלורסנציה יוצגה באמצעות ערכים המבטאים את היעילות הקוונטית (הנמצאים ביחס הפוך זה לזה).

<בחזרה לראש הפרק

ח. Patch-clamp experiment
פרוטופלסטים של תאי הסגירה בודדו מצמחי V.faba בני 3-4 שבועות, באמצעות עיכול אנזימטי, מתוך מטרה למדוד את השינויים בזרם הסידן והאשלגן שבממברנה בפלסמטית של פרוטופלסט תאי הסגירה, בשיטת ה-whole cell patch clamp.
לאחר הבידוד נשמרו הפרוטופלסטים בחושך בטמפרטורה של 0-2°C למשך שעה, בתוך תמיסה שהכילה 500µM CaCl2, 500µM MgCl2, 450mM sorbitol, 5mM MES.קוטר הפרוטופלסטים שנמדד היה בין 16-19µm.
.הקלטת הזרמים נעשתה באמצעות מגבר שחובר למחשב. עבור כל ניסוי ניתן פולס גירוי ונעשתה אנליזה לנתונים.
- עבור זרם אשלגן:
התמיסה שהועברה אל אלקטרודת הזכוכית (pipette solution) הכילה 80mM k⁺glutamate, 20mM KCl, 10mM HEPES, 2mM Mgcl2, 2mM ATP, pH7.8. תאי הסגירה נשטפו בשטיפה חוץ תאית בתמיסה שהכילה 5mM Mgcl2, 1mM Cacl2, 10mM HEPES, 100mM k⁺glutamate, pH7.2.
- עבור זרם סידן:
התמיסה שהועברה אל אלקטרודת הזכוכית הכילה: 100 mM BaCl2, 10mM HEPES, 4mM EGTA, pH7.5.
הפרוטופלסטים נשטפו ב: 100mM BaCl2/CdCl2/CaCl2, 10mM MES, Ph6.5.
בתנאים אלו, פוטנציאל שיווי המשקל של יוני Ba⁺² ו^-Cl היה 28mV+ ו57mV- בהתאמה. בכל הניסויים הוסף sorbitol, מתוך מטרה להתאים את האוסמולאליות באלקטרודת הזכוכית ובתמיסת השטיפה לערכים של 480 ו-460mmol/Kg בהתאמה.
בניסוי הבקרה הוקלטו זרמי אניון מתוך תעלות אניוניות שנמצאות בממברנה הפלסמטית של פרוטופלסט תאי הסגירה בצמחי V.faba. לאחר הכנת המערכת כפי שתואר לעיל, פוטנציאל הממברנה נשמר בערך של 0mV למשך 5 דקות ואז הועבר גירוי שגרם להקפצת הפוטנציאל לערך של 120mV למשך 50 שניות. אחוז העיכוב נמדד על סמך זרם ה-peak. כל הניסויים בוצעו בטמפרטורת החדר (2-/+22°C).

מקורות

Leonhardt, N., Marin, E., Vavasseur, A. and Forestier, C. (1997) Evidence for the existence of a sulfonylurea-receptor-like protein in plants: modulation of stomatal movements and guard cell potassium channels by sulfonylureas and potassium channel openers. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 94, 14156–14161.

Leonhardt, N., Vavasseur, A. and Forestier, C. (1999) ATP-binding cassette modulators control abscisic acid regulated slow anion channels in guard cells. Plant Cell, 11, 1141–1151.

בחזרה לראשית
בחזרה לראש הפרק

תוצאות הניסויים
השפעת קדמיום על מוליכות העלה
השפעת קדמיום על משקל השורש והנצר וכן על תכולת הקדמיום ברקמות
השפעת קדמיום על אסימילציה של CO2 בהשוואה להשפעתו על מוליכות העלה
השפעת קדמיום על שלמות המערכת הפוטוסינטטית
השפעת קדמיום על סגירת הפיוניות
בדיקת הקשר בין אינדוקציה של סגירת הפיוניות על ידי קדמיום לעקת מים
השפעת CdCl2 על תעלות האשלגן שבתאי הסגירה
בחינת ההשפעה של מעכבי תעלות סידן על האפקט של קדמיום, באינדוקציה של סגירת הפיוניות
בחינת חדירות תעלות הסידן ליוני קדמיום

השפעת קדמיום על מוליכות העלה
צמחי תודרנית לבנה טופלו במשך שבוע בריכוזים עולים של קדמיום (10,20,50,100 µM), בתנאים של תמיסה היפוטונית.
בהעדר קדמיום, נצפה ריתמוס יומי קלאסי של מוליכות העלה, אשר הייתה גבוהה ביום (שיא לאחר 5 שעות) ונמוכה יותר בלילה.
העובדה שבלילה התקבלו ערכים משמעותיים של מוליכות עלה, נובעת מהתנאים בהם נערך הניסוי: הימצאות בתמיסה היפוטונית ולחות יחסית של 70%, מתוך מטרה להימנע ממצבים של עקת מים. תוספת של 10µM קדמיום לתמיסת הנוטריינטים לא השפיעה בצורה משמעותית על מוליכות העלה, אך תוספת של ריכוזים גבוהים יותר, 20-100µM, גררה ירידה במוליכות שהייתה בקורלציה חיובית עם הריכוז.

איור 1. קדמיום גורם לירידה במוליכות העלה כתלות בריכוזו.שינויים יומיים נצפו במוליכות העלה של צמחי תודרנית לבנה, בתנאים של תמיסה הידרופונית וריכוזים שונים של קדמיום. החץ מצביע על הזמן שבו הוכנס הקדמיום לתמיסת הנוטריינטים. התיבות השחורות והלבנות מייצגות את תקופת היום והלילה. כל הערכים המוצגים בניסוי בודד הינם ממוצע של 3 טריפליקאטים.

חזרה לראש הפרק

השפעת קדמיום על משקל השורש והנצר וכן על תכולת הקדמיום ברקמות
צמחי תודרנית לבנה טופלו במשך שבוע בריכוזים עולים של קדמיום (10,20,50,100 µM), בתנאים של תמיסה היפוטונית. תוספת של קדמיום לתמיסת הנוטריינטים גרמה לעיכוב חזק בגידול השורש ולעיכוב מופחת יותר בגידול הנצר (איור 2a). כמו כן, תכולת הקדמיום ברקמת השורש הייתה גבוהה מאוד, אך כ-40% מהקדמיום הצטבר בנצר בריכוזים שהם טווח של 10-50µM (איור 2b). אם כן, ההפחתה במשקל הטרי של השורש והעלה קשורה באופן ישיר להצטברות הקדמיום ברקמות (איור 2c).

איור 2. קדמיום מעכב את הגידול כתלות בריכוזו. (a) ירידה במשקל הטרי של השורש והנצר של צמחי תודרנית לבנה שטופלו במשך שבוע בקדמיום כתלות בריכוזו. (b) היחס שבין ריכוז הקדמיום בתמיסה לריכוזו ברקמות השורש והנצר. ניתן לראות שקיימת קורלציה חיובית בין השניים. (c) היחס בין המשקל הטרי של רקמות השורש והנצר לריכוזו ברקמות.
כל ערך מייצג ממוצע -/+ SEM של שלושה מדידות בלתי תלויות.

חזרה לראש הפרק

השפעת קדמיום על אסימילציה של CO2 בהשוואה להשפעתו על מוליכות העלה
השפעת הקדמיום על שני הפרמטרים לעיל נבדקה בצמחי תודרנית לבנה, לפני ואחרי הוספת הקדמיום למדיום, בריכוזים עולים (10,20,50,100 µM). רק אחרי הוספה של 20µM קדמיום למדיום נצפתה ירידה מסוימת בשני הפרמטרים לאחר 3 ימים (איור 3b). תוספת של 50µM למדיום גררה ירידה חזקה בשני הפרמטרים, אך ירידה חזקה יותר במוליכות העלה (פי 2) לאחר יומיים (איור 3c). האפקט שנצפה לאחר תוספת של 50µM היה חזק יותר כאשר הוסף 100µM קדמיום למדיום (איור 3d).

איור 3. קדמיום גורם לירידה מקבילה במוליכות העלה ובאסימילציה של CO2 כתלות בריכוזו.המוליכות המקסימאלית של העלה (עיגולים לבנים) ואסימילציה של CO2 (עיגולים מושחרים) נבדקו לאחר הוספת ריכוזים עולים של קדמיום, כתלות בזמן.
החץ מצביע על זמן האפליקציה של הקדמיום למדיום. כל ניסוי מייצג ממוצע של 3 חזרות.

חזרה לראש הפרק

השפעת קדמיום על שלמות המערכת הפוטוסינטטית
השפעת תוספת ממושכת של 50µM קדמיום (בצורת CdCl2) על שלמות המערכת הפוטוסינטטית, נבדקה בצמחי תודרנית לבנה, באמצעות בדיקת האפקטיביות של היעילות הקוונטית של מערכת אור 2, כתלות בזמן.לפי התוצאות ניתן לראות כי לתוספת של 50µM קדמיום אין השפעה על היעילות הקוונטית והערכים שהתקבלו היו באותו סדר גודל של ניסוי הביקורת.

איור 4. היעילות הקוונטית של מערכת אור 2 לא משתנה עקב טיפול בקדמיום. השפעת תוספת של 50µM (עיגולים מושחרים) על היעילות הקוונטית כתלות בעוצמת האור בהשוואה לביקורת (עיגולים לבנים) נבדקה לאחר 1, 3, ו-6 ימים מזמן הוספת המתכת לרקמת השורש. כל ערך מייצג את הממוצע -/+ SEM של שלושה צמחים בלתי תלויים.

חזרה לראש הפרק

השפעת קדמיום על סגירת הפיוניות
על מנת לבדוק את השפעת קדמיום על סגירת הפיוניות, נבחנה השפעת תוספת של ריכוזים עולים מערכיים של קדמיום על קליפות אפידרמאליות של צמחי A.thaliana, V.faba ו-C.communis. הרצועות האפידרמאליות שהו למשך 2.5 שעות בתמיסה המכילה ריכוזים שונים של CdCl2. בתוצאות נצפה אפקט דואלי: ריכוזי קדמיום בננומולר ומיקרומולר גרמו לעיכוב משמעותי בפתיחת הפיוניות תחת אור (איור 5a) בעוד שריכוזים גבוהים יותר מ 10µM גרמו לסופרסיה של אפקט העיכוב. יתרה מכך, ריכוזים אלו הגבוהים מ 10µMגרמו לאינדוקציה בפתיחת הפיוניות בחושך (נתונים לא הוצגו במאמר). אפקט דואלי כזה נצפה גם כאשר הוסף יון סידן (Ca⁺²) במקום קדמיום, מה שיכול להצביע על מעורבות של תהליך משותף אשר גורם לאפקטים הדומים.

בסדרת ניסויים נוספת, נבדקה ההשפעה של תוספת 50µM קדמיום על גודל נקב הפיונית ועל ריכוזו ברקמת השורש והנצר, בצמחי תודרנית לבנה מקו Lansberg erecta ומוטנטים abi1-1. הצמחים היו בני 4-5 שבועות והחשיפה לקדמיום הייתה במשך 4 ימים ב-phytotron. בכל יום בניסוי, נאסף עלה מהצמח באמצע תקופת האור, בזמן שבו הטרנספירציה הייתה מקסימאלית והועבר לצורך מדידת גודל הנקב. במקביל נמדדה בצמח תכולת הקדמיום ברקמות השורש והנצר.
בקו Lansberg erecta ובמוטנט abi1-1, כבר אחרי 24 שעות, תוספת של קדמיום למדיום גררה עיכוב בפתיחת נקב הפיונית וכן הצטברות של המתכת ברקמות השורש והנצר (איורים 5b,c).

איור 5. השפעת קדמיום בוויסות פתיחת הפיונית במינים שונים. (a) ריכוזים נמוכים של קדמיום מעכבים את פתיחת הפיוניות תחת אור, בצמחים: A.thaliana (משולש), V.faba(ריבוע), C.communis(עיגול), בעוד שריכוזים גבוהים גורמים לפתיחת הפיוניות. (b) – (c) אפקט של סגירת הפיוניות בקו Lansberg erecta ובמוטנט abi1-1 נמצא בקורלציה להצטברות הקדמיום ברקמות הצמח A.thaliana. נקב הפיונית (תיבה אנכית) ותכולת הקדמיום בשורש (ריבוע) ובנצר (עיגול) נקבעו לאחר הוספה של 50µM בזמן 0 ולאחר 4 ימים. המדידות של נקב הפיונית נערכו לאחר איסוף של עלה מהצמח מידי יום ואילו המדידות של תכולת הקדמיום ברקמות נעשתה על פני הצמח. הערכים מציגים ממוצע -/+ SEM, של ארבעה ניסויים בלתי תלויים.

חזרה לראש הפרק

בדיקת הקשר בין אינדוקציה של סגירת הפיוניות על ידי קדמיום לעקת מים
על מנת לברר האם סגירת הפיוניות תחת הוספה של קדמיום נובע מעקת מים, נבדקו שינויים בתכולת המים היחסית – RWC
(relative water content), במהלך ניסוי של 3 ימים שכלל הוספה של 50µM קדמיום. לפי התוצאות, הטיפול בקדמיום לא גרם למחסור במים מאחר וה-RWC עבור הביקורת ועבור צמחים שטופלו במתכת היה באותו סדר גודל: 4.8+/- 81.3% ו 3.1 +/-83.6% בהתאמה (n=11). תוספת של 2µM ABA יומיים לפני ובמהלך 3 ימי טיפול ב50µM קדמיום, לא שינתה את כמות הקדמיום שהצטברה בשורש (n=6), אך כן עיכבה משמעותית את המעבר שלו לנצר ( 0.003+/- 0.0166 mg Cd⁺²g^-1 DW). תוצאה זו יכולה לרמוז שמעבר הקדמיום מהשורש לנצר בצמח תלוי בזרם הטרנספירציה, המווסת על ידי הפיונית.
אותו מהלך ניסוי נעשה גם במוטנט abi1-1, בו הפיוניות לא מגיבות להורמון ABA וכן הוא לא סוגר אותן תחת עקת יובש. כאשר נחשף המוטנט לקדמיום בריכוז של 50µM, נצפתה ירידה במוליכות העלה (נתונים לא הוצגו במאמר) וסגירה של פיוניות שהייתה בקורלציה להצטברות הקדמיום ברקמת העלה (איור 5c) וזאת ללא שינוי בערכי RWC.
(2.2+/- 78.2% ו- 2.6+/-82.7%, בביקורת ובצמחים שטופלו בהתאמה, n=9).
על סמך תוצאות אלו ניתן להסיק שסגירת הפיוניות, עקב טיפול בקדמיום, הינה אפקט בלתי תלוי בעקת מים, המערבת את ההורמון ABA.
נקודה מעניינת נוספת היא שמוטנטים אלו, המאופיינים בקצב טרנסיפרציה גבוה (Lyemarie et al., 1998), לא הציגו תכולה גבוהה יותר של קדמיום ברקמות מאשר צמחי בר וזאת למרות תוצאות קודמות, שהוכיחו שמעבר הקדמיום במסלול השורש-נצר תלוי בזרם הטרנספירציה. יתכן שקיים שלב מעכב בטרנספורט של קדמיום, אשר מונע הצטברות זו.

חזרה לראש הפרק

השפעת CdCl2 על תעלות האשלגן שבתאי הסגירה
השפעה זו של קדמיום נבדקה בתאי הסגירה של צמחי V.faba. הזרם הפנימי והחיצוני של התעלות הוקלט בשיטת ה-whole cell patch , כאשר בכל ניסוי אותו פרוטופלסט הוקלט לפני ואחרי שטיפה ב-CdCl2. הניסוי כלל בדיקה של ריכוזים רבים בטווח שבין 1nM-5mM
(N=15). התוצאות הראו חוסר רגישות של הזרמים לתוספת של CdCl2 בריכוזים של 10µM ו-5mM וזאת בניגוד לנצפה בצמח S.saman, בו הייתה השפעה של 100µM קדמיום על זרם האשלגן (Moran et al., 1990). הירידה הספונטאנית בזרם האשלגן כתלות בזמן (נקרא גם תופעת rundown), הייתה גבוה יותר או שווה לזו שנצפתה לאחר הוספת קדמיום. מתוצאות אלו ניתן להסיק שהשפעת קדמיום על מנגנון הפתיחה של הפיוניות לא קשורה לרגולציה על הפתיחה והסגירה של תעלות האשלגן.

איור 6. השפעת קדמיום על תעלות האשלגן בתאי הסגירה. (a) ה-rundown של זרם האשלגן החיצוני (ריבועים מלאים) והפנימי (עיגולים מלאים) בתנאי ביקורת. הערכים מציגים ממוצע +/- SEM של 45 ניסויים בלתי תלויים. התיבה האפורה והלבנה מייצגות את ממוצע הזרם הפנימי והחיצוני של תעלת האשלגן לאחר הוספה של 10µM ו-5mM קדמיום בהתאמה, לפי הזמן המצוין על הגרף.
(b) הקלטת הזרם הפנימי והחיצוני של אשלגן בביקורת ולאחר הוספה של 5mM קדמיום, בהתאם למה שתואר ב-a.

חזרה לראש הפרק

בחינת ההשפעה של מעכבי תעלות סידן על האפקט של קדמיום, באינדוקציה של סגירת הפיוניות
מהלך הניסוי כלל השהייה של פיוניות, מרצועות אפידרמאליות של צמחי A.thaliana ו-V.faba, באור במשך 2.5 שעות ובהמשך הוספה של מעכבים שונים לתעלת סידן כחצי שעה לפני הוספת CdCl2. המעכבים שהוספו היו: dihydropyridines nifedipine, SDZ, verapamil ו-La⁺³. בשני המינים, כל המעכבים שהוספו לפני תוספת הקדמיום גרמו למניעת האפקט של סגירת הפיוניות על יד קדמיום (איור 7a). מתוצאות אלו ניתן לשער שקדמיום נכנס לתאי הסגירה דרך תעלות הסידן.

חזרה לראש הפרק

בחינת חדירות תעלות הסידן ליוני קדמיום
מהלך הניסוי כלל שימוש ביון Ba⁺² במקום Ca⁺² (מתוך מטרה לשפר את ההקלטה וכן למנוע רעש רקע מתעלות האשלגן) ובחינה האם תעלות הסידן חדירות ל Ba⁺²ולCd⁺². התמיסה שאליה הוכנסו הפרוטופלסטים הכילה מדיום שכלל תחילה BaCl2, בהמשך CaCl2 ולבסוף CdCl2 (איור 7b). כאשר נכח במדיום 100mM Ba⁺² הייתה עלייה מהירה במתח מ20mV+ ל160mV-. לא נצפה זרם עבור פוטנציאל ממברנה חיובי. פוטנציאל שיווי המשקל עבור Ba⁺² חושב על סמך אקסטרפולציה וערכו שווה ל-2.9+/-10.2mV .
ערך זה קרוב לערך התיאורטי של פוטנציאל שיווי המשקל עבור יון זה – EBa = +28Mv. כאשר היון Ba⁺² הוחלף ב- Ca⁺²או ב-Cd⁺², פוטנציאל שיווי המשקל, שחושב גם כן על ידי אקסטרפולציה, לא השתנה באופן משמעותי.על סמך תוצאות אלו ניתן להסיק שהזרמים בתעלות כלפי פנים, נובעים מת עלות הסידן וחדירותן ליוני: Ba⁺² Cd⁺².
ניסוי נוסף הראה שתוספת של La⁺³ למדיום, עיכבה את זרמי היונים Ba⁺² ו-Ca⁺² ובניסוי מקביל גם את זרם יוני הקדמיום (איור 7c,d). על מנת לוודא שריכוזי יוני הכלור הגבוהים לא גררו השפעה של תעלות אניוניות על הקלטות הזרמים, נבדקה השפעה של מעכב תעלות אניוניות בתאי הסגירה על זרם היון Ba⁺². המעכב היה NPPB – 5-nitro-2,3-phenylpropylaminobenzoic. התוצאות הראו חוסר השפעה של NPPB על זרם Ba⁺² ולא נצפה עיכוב (איור 7e) אך כן נצפה עיכוב בזרם התעלה האניונית (איור 7f).
מתוך תוצאות אלו ניתן לשער שתעלות הסידן שבממברנה הפלסמטית של תאי הסגירה חדירות ליוני קדמיום. יתכן שיוני קדמיום מסוגלים לחקות מבחינה מבנית את יוני הסידן ובכך להיכנס לתאי הסגירה דרך תעלות הסידן.

איור 7. מעכבי תעלת סידן מדכאים את האפקט של יוני קדמיום בסגירת הפיוניות וכן תעלות הסידן שבממברנה הפלסמטית של תאי הסגירה, חדירות ליוני קדמיום.(a) הפיוניות פתוחות תחת אור (תיבה לבנה). פתיחתן מעוכבת במהלך טיפול ב-100nM Cd⁺² (תיבה מושחרת). הוספת מעכבים שונים וCd⁺², מדכאת את האפקט שנצפה בעת הוספת Cd⁺² לבד (תיבות מושחרות).
(b)– (e) – היפרפולריזציה של הממברנה הפלסמטית של תאי הסגירה מ-20mV ל-180mV-. הזרם הפנימי הוקלט באמצעות שיטת ה-whole cell patch .
(b) – פרוטופלסט תאי סגירה שנשטף בתמיסות 100mM BaCl2, CaCl2, CdCl2 .
(c) – (d) - זרמי היונים Ba⁺² ו- Cd⁺² עוכבו לאחר תוספת של 100µM La⁺³.
(e) – תוספת NPPB, המהווה מעכב לתעלות אניוניות, לא השפיעה על זרם היון Ba⁺².
(f) – תוספת NPPB כן חסמה את זרם התעלה האניונית, כאשר ההקלטה כוונה למדידת זרם זה.

חזרה לראש הפרק
בחזרה לראשית
ראה הסבר על מעכבי תעלות סידן



דיון בתוצאות
חשיפת מינים שונים של צמחים לקדמיום, הציגה בעבר אפקטים שונים של המתכת בכל צמח. מחקרים שבדקו את השפעת קדמיום על הפזיולוגיה של צמחי Brassica napus ו-Brassica juncea הציגו תוצאות מנוגדות, כאשר בB.napus המתכת גרמה לעיכוב בגדילה, לירידה בתכולת הכלורופיל וביעילות הקוונטית של הפוטוסינתזה וכן לסגירת הפיוניות, בעוד שבB.juncea המתכת גרמה לירידה בקצב הטרנספירציה בלבד, ללא אפקטים הקשורים לתהליך הפוטוסינתזה.(Baryla et al., 2001; Larsson et al., 1998; Haag-kerwer et al., 1999),
התוצאות במאמר זה, מציגות אפקטים שונים של קדמיום על צמחי A.thaliana, V.faba ו- C.communis, הנובעים מחשיפה ממושכת למתכת ותלויים בריכוזו במדיום.
כאשר חשפו צמחי A.thaliana לריכוזים עולים של קדמיום, נצפה אפקט שלילי של המתכת על מוליכות העלה וקליטת CO2. ירידה בשני הפרמטרים שהוזכרו נצפתה רק כאשר הריכוזים היו מעל 10µM, בעוד שריכוזים נמוכים יותר לא השפיעו על הצמח. הסיבה לכך נובעת כנראה מיכולתו של הצמח להתמודד עם טווח ריכוזים זה, באמצעות תהליכים של דה טוקסיפיקציה. בנוסף, טווח ריכוזים זה גרם גם כן לירידה במשקל הטרי של השורש והנצר וכן לעיכוב בגידולם. עבור כל הפרמטרים שנבדקו, האפקט של המתכת היה בקורלציה חיובית עם ריכוז הקדמיום במדיום.
כאשר נבדקה שלמות המערכת הפוטוסינטטית בין צמחי ביקורת של תודרנית לבנה לצמחים שטופלו ב50µM קדמיום, לא נראה הבדל ביעילות הקוונטית (של מערכת אור 2) בין השניים, דבר התואם את התוצאות שהתקבלו עבור Haag-kerwer et al., 1999) Brassica juncea) .
העדר פגיעה במערכת הפוטוסינטטית הינה עדות למנגנון הגנתי יעיל של המערכת כנגד האפקט הרעיל של המתכת. לכן, מאחר ועיכוב בפתיחת הפיוניות והשרית סגירתן נצפתה תחת רצועות אפידרמליות של צמחי A.thaliana, V.faba ו-C.communis, ניתן לשער שזהו הגורם לירידה בקליטת CO2 ולא שלמות המערכת הפוטוסינטטית, שכאמור לא נפגעה.

תוצאות אלו ממחישות את ההשפעה של ריכוזים רעילים של המתכת על מאזן המים בצמח. ירידה במוליכות העלה יכולה להיות מוסברת על ידי סינתזת ההורמון ABA במקביל לקליטת המתכת. אך מאחר ולא נצפו הבדלים בין ערכי RWC של צמחי ביקורת לאלו שטופלו ב-50µM ניתן להסיק כי הירידה במוליכות העלה נובעת מקליטת קדמיום ולא מעקת מים הכוללת סינתזת ABA. יתרה מכך, העובדה שבמוטנטים abi1-1, בהם מבוטלת ההשפעה של ההורמון ABA על הצמח (שכן הם חסרי רגישות אליו), נצפו אותן התוצאות של חוסר שינוי בערכי RWC בין צמחי ביקורת לניסוי וכן ירידה במוליכות העלה, מחזקת את חוסר המעורבות של ABA בהורדת מוליכות העלה.
תמיכה לכך שירידה במוליכות העלה מתבצעת במסלול שאינו תלוי ב-ABA מתקבלת מתוצאות המאמר Poschenrieder et al., 1989. התוצאות מראות שאין קורלציה בין ריכוזי קדמיום לריכוזי ABA בעלים ובשורשים. עלייה בריכוזי הקדמיום ברקמות אלו והאפקט של סגירת הפיוניות נצפו מייד לאחר הטיפול במתכת, בעוד שריכוז ה-ABA נשמר נמוך מאוד ורק לאחר 120 שעות מזמן הקציר נצפתה עלייה בריכוזו.
מכאן שבנוסף לירידה בקליטת CO2, סביר שגם ירידה במוליכות העלה נובעת באופן ישיר מסגירת הפיוניות, המושרת לאחר קליטת קדמיום מהמדיום. לפי התוצאות, ריכוזי קדמיום בננו ומיקרומולר גרמו לסגירת הפיוניות בצמחי A.thaliana, V.faba ו-C.communis וכן ריכוז של 50µM קדמיום גרם לאותו אפקט במוטנט abi1-1 תוך 24 שעות. עצם העובדה שסגירת הפיוניות נצפתה גם במוטנט מחזקת את העובדה שהשפעת קדמיום מתבצעת במסלול שאינו תלוי ב-ABA.

בבחינת הסיבה לסגירת הפיוניות המושרת על ידי קדמיום, נבדקה האפשרות של רגולציה על הפתיחה והסגירה של תעלות אשלגן. תוצאות שיטת whole cell patch עבור תעלות האשלגן של תאי הסגירה ב- V.faba מבטלות אפשרות זו, מאחר ונצפתה חוסר רגישות של זרמי יוני אשלגן לתוספת של ריכוזי קדמיום במדיום.
רגולציית הפתיחה והסגירה של תעלות סידן נבחנה גם כן. תוספת של מעכבי תעלת סידן למדיום במקביל לתוספת של קדמיום, עיכבה את אפקט סגירת הפיוניות המושרה על ידי קדמיום. תמיכה לכך מתקבלת מקורלציה בין התוצאות שהתקבלו במאמר זה עבור יחסי זרם-מתח, פוטנציאל שיווי המשקל ועיכוב האפקט על ידי La⁺³ לבין התוצאות ממאמרים קודמים (Hamilton et al., 2000; Pei et al., 2000).
על סמך תוצאה זו ניתן לשער כי קדמיום חודר לתאים דרך תעלות הסידן , עובדה שנצפתה בעבר בתאים אנימאליים (Olivi and Bressler., 2000; Usai et al., 1999) וכן בתאי שורש חיטה (White, 2000).
הכותבים מציעים כי יון הקדמיום מחקה את יון הסידן ועל ידי כך נכנס תאי השמירה דרך תעלת הסידן. האפקט הרעיל שלו יכול לנבוע כתוצאה מהפרעה לרמת הסידן התוך תאי. מחקרים שבוצעו בתאים אנימאליים מספקים להשערה זו תמיכה, מאחר והם מציגים את היכולת של קדמיום להגביר את שחרור יוני הסידן ממאגרים פנימיים כמו ER והוקואולה. מחקרים נוספים הציגו את היכולת של קדמיום להחליף את הסידן ברגולציה של קלמודולין, אשר מהווה מתווך לאפקטים של סידן ולאקטב אותו.

לקדמיום יש השפעה פלאוטרופית, שתחילתה היא יכולתו להיכנס דרך תעלות הסידן שבתאי הסגירה של הפיונית והפרעה למסלול העברת הסיגנלים המושרה על ידי סידן. מבחינה פיזיולוגית, הקדמיום משפיע על גידול הצמח וגורם לסגירת הפיוניות, במסלול שאינו תלוי בהורמון ABA, שגוררת ירידה במוליכות העלה ובקליטת CO2 מהאוויר.
על מנת להבין טוב יותר את השפעת הקדמיום על הצמח מבחינה מיקרוסקופית ומקרוסקופית, יש לערות מחקרים נוספים שיספקו אינפורמציה נוספת לאינטראקציה של קדמיום עם תעלת הסידן ולמנגנון שעומד מאחורי השפעותיו על מאזן המים בצמח והשפעות פיזיולוגיות אחרות.

מקורות

Baryla, A., Carrier, P., Franck, F., Coulomb, C., Sahut, C. and Havaux, M. (2001) Leaf chlorosis in oilseed rape plants (Brassica napus) grown on cadmium-polluted soil: causes and consequences for photosynthesis and growth. Planta, 212, 696–709

Cheung, W.Y. (1988) Calmodulin and its activation by cadmium ion. Ann. N.Y. Acad. Sci. 522, 74–87

Haag-Kerwer, A., Schafer, H.J., Heiss, S., Walter, C. and Rausch, T. (1999) Cadmium exposure in Brassica juncea causes a decline in transpiration rate and leaf expansion without effect on photosynthesis. J. Exp. Bot. 341, 1827–1835

Hamilton, D.W.A., Hills, A., Kohler, B. and Blatt, M.R. (2000) Ca2+ channels at the plasma membrane of stomatal guard cells are activated by hyperpolarization and abscisic acid. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 97, 4967–4972

Olivi, L. and Bressler, J. (2000) Maitotoxin stimulates Cd 2+ influx in Madin–Darby kidney cells by activating Ca-permeable cation channels. Cell Calcium, 27, 187–193

Pei, Z.M., Murata, Y., Benning, G., Thomine, S., Klusener, B., Allen, G.J., Grill, E. and Schroeder, J.I. (2000) Calcium channels activated by hydrogen peroxide mediate abscisic acid signaling in guard cells. Nature, 406, 731–734

Poschenrieder, C., Gunse, B. and Barcelo, J. (1989) Influence of cadmium on water relations, stomatal resistance and abscisic content in expanding bean leaves. Plant Physiol. 90, 1365–1371

Suzuki, Y., Chao, S.H., Zysk, J.R. and Cheung, W.Y. (1985) Stimulation of calmodulin by cadmium ion. Arch. Toxicol. 57, 205–.211

Usai, C., Barberis, A., Moccagatta, L. and Marchetti, C. (1999) Pathways of cadmium influx in mammalian neurons. J. Neurochem. .72, 2161–2154

.White, P. (2000) Calcium channels in higher plants. BBA Acta, 1465, 171-189

בחזרה לראשית

המשך מחקר
השפעת קדמיום על הצמח מתבטאת באספקטים שונים. התוצאות המוצגות במאמר זה עונות על שאלת המחקר שהוצגה ולפיהן קדמיום משפיע על מאזן המים בצמח אך באופן שאינו תלוי במסלול ההורמון ABA. השפעותיו מתבטאות בירידה במוליכות העלה, הפחתה בקליטת פחמן דו חמצני וסגירת הפיוניות. כמו כן, הוא מסוגל לחדור דרך תעלת הסידן.
התוצאות המוצגות במאמר מחזקות צד אחד בויכוח של השפעת המתכת קדמיום על תהליך הפוטוסינתזה ומאזן המים בצמח. כאמור לא נצפו שינויים בשלמות המערכת הפוטוסינטטית שכן גם היעילות הקוונטית וגם ערכי RWC נשמרו על אותם ערכים , בין צמחי ביקורת לצמחים שטופלו. זאת בניגוד לתוצאות שהתקבלו עבור Baryla et al., 2001) Brassica napus) . על מנת לקבל תוצאות המשקפות נאמנה את ההבדל בהשפעת קדמיום, יש לדעתי לערוך ניסוי נוסף המשלב את שני הצמחים (ארבידופסיס וB.napus ) ולבחון מחדש את השפעת קדמיום על תהליך הפוטוסינטזה ובפרט את היעילות הקוונטית. במידה ויתקבלו תוצאות התומכות בממצאים הקודמים , יש להסיק כי לקדמיום השפעה דואלית על תהליך הפוטוסינתזה ויש לערוך מחקרים נוספים , שינסו להסביר את העומד מאחורי השפעה זו.
את השפעת קדמיום על מאזן המים בצמח ניתן לבדוק באמצעות בחינה של פרמטרים נוספים כמו פוטנציאל המים, פוטנציאל אוסמוטי ופוטנציאל הלחץ ההידרוסטטי. העדר שינוי בפרמטרים אלו, בין צמחי ביקורת לצמחים מטופלים, יעיד על חוסר השפעה של קדמיום ויחזק את התוצאות המוצגות במאמר.
ההשפעה על מנגנון הפתיחה והסגירה של תעלות הסידן, מתוך מטרה לוודא את חדירת המתכת דרכן, יכולה להיבדק באמצעות שני אפקטים מנוגדים. ראשית, ניתן להשתמש במעכבים נוספים לתעלות סידן, פרט לאלו בהם נעשה שימוש במאמר ולבחון האם אין שינוי בעוצמת ההשפעה של המתכת ובעוצמת תגובות הצמח. מעכבים אלו יכולים להיות: Al⁺³, Gd⁺³, heparine, procaine ואחרים.
שנית ניתן להשתמש באקטיבטורים, הגורמים לתעלות הסידן להישאר פתוחות כל הזמן, ללא חזרה למצב הסגור. שימוש בחומרים אלו צפוי להעלות משמעותית את ריכוז הקדמיום ברקמות בהנחה שהוא אכן חודר דרך תעלות הסידן. חומר שהוכח כמאקטב את הפתיחה של תעלות סידן וגורם להם להישאר פתוחות זמן ממושך יותר הוא Bay K 8644 ובו ניתן להשתמש. (Roblin., G. et al. 1989).

בנוסף, ניתן להגדיל את מגוון השיטות בהן נעשה שימוש, על מנת לאמת את התוצאות ולחזקן.
למשל, על מנת לחזק את הסברה לפיה: קיים אי תלות בין סגירת הפיוניות לסינתזה של ההורמון ABA, ניתן לבדוק את תכולת ה-ABA ברקמה באמצעות (HPLC (High Performance Liquid Chromatography. השיטה בוצעה במאמר Poschenrieder et al., 1989 ובאמצעותה הושוותה תכולת ההורמון ABA, בין צמחי שעועית שטופלו בקדמיום לצמחי ביקורת. במידה ואכן קיים החוסר תלות בין שני הפרמטרים לא נצפה לשינוי בכמות ההורמון ליחידת מסת צמח.
בבחינת ההשפעה על סגירת הפיוניות הצמח, ניתן להשתמש בשיטות נוספות המודדות את קצב קליטת הפחמן דו חמצני. ניתן לערוך ניסוי המשלב אינקובציה של הצמחים עם איזוטופ רדיואקטיבי של פחמן C14, הפולט קרינה ובכך מאפשר מעקב אחריו. השוואה בין מספר ההתפרקויות (dpm) של צמח שטופל בקדמיום לעומת צמח ביקורת, תוכל לספק מידע אודות מצב הפיוניות בצמח. למרות שלשיטה מספר חסרונות, (שימוש בחומרים מסוכנים, זמן ארוך וסיכוי גבוה לטעויות אנוש) היא מאוד מדויקת ומאפשרת בנוסף לחשב אף את ה-net photosynthesis, מאחר והיא לוקחת בחשבון נשימה ופוטורספירציה.
בנוסף, ניתן לבחון את תכולת הקדמיום בצמח באמצעות הפעלת הפרומוטור של הגן לmetallothionein. במאמר נעשה שימוש במכשיר ה- flame atomic absorption spectrophotometer, לטובת בחינה של תכולת הקדמיום בצמח. מאחר וסינתזת metallothionein מוגברת בעקבות חשיפה למתכת, ניתן לבדוק ביטוי של גן מדווח המחובר לפרומוטור של MT, בצמחים טרנסגנים שנחשפו למתכת לעומת צמחי ביקורת. הגן המדווח יכול להיות GFP, כאשר הקביעה לגבי תכולת הקדמיום בצמח תהיה איכותית בלבד. קורלציה חיובית בין שתי השיטות תאפשר קבלה של תוצאות מהימנות יותר. יש לציין שהפרומוטור של phytochelatin יכול להיות במקום MT.
שיטה של proteomics - microarray תוכל גם כן לספק מידע נוסף אודות החלבונים שעולים או יורדים ברמתם בצמח, עקב חשיפה למתכת. חלבונים אלו יכולים להיות חלק מתגובת הגנה או עמידות בצמח, חלק מתהליך הובלת המתכת בצמח ואפשרויות אחרות.

במהלך השנים נבדקה השפעת קדמיום על מינים שונים של צמחים, דו פסיגיים וחד פסיגיים, המשתייכים למשפחות שונות. מאחר ולעיתים התקבלו תוצאות מנוגדות גם בין צמחים המשתייכים לאותה המשפחה, אין ספק שאפיון התגובות של מינים נוספים של צמחים כתוצאה מחדירת ריכוזים שונים של קדמיום לצמח, יגדיל את המידע הקיים אודות השפעות המתכת ואולי יאפשר הבנה טובה יותר של המנגנון הביוכימי והמולקולארי, באמצעותו קדמיום חודר לצמח ומשפיע על אספקטים שונים הקשורים למאזן המים בצמח ולפיזיולוגיה שלו. הבנת המנגנון הכרחית הן לטובת הבנת האופן שבו קדמיום משפיע על הצמח (בעיכוב צמיחת השורש למשל) והן לצרכי ביוטכנולוגיה, שיאפשרו פיתוח של צמחים עמידים כנגד המתכת וצמחים המסוגלים לצבור אותה בכמויות גדולות ללא גרימת נזק.

מקורות

Poschenrieder, C., Gunse, B. and Barcelo, J. (1989) Influence of cadmium on water relations, stomatal resistance and abscisic content in expanding bean leaves. Plant Physiol. 90, 1365–1371

Roblin, G., Fleurat-Lessard, p., Bonmort, J. (1989) Effects of Compounds Affecting Calcium Channels on Phytochrome- and Blue Pigment-Mediated Pulvinar Movements of Cassia fasciculata.Plant Physiol. 90, 697–701

בחזרה לראשית

המכשירים בהם נעשה שימוש
Dew point hygrometer
Differential infrared gas analyzer
Flame atomic absorption spectrophotometer
National Instruments Labview
Pulse amplitude modulation fluorometer
Quantum meter
Thermistor probe

Dew point hygrometer
Dew point: הטמפרטורה שבה אדי המים נדחסים למצב צבירה נוזל ומופיע טל. על מנת שזה יקרה האוויר חייב להתקרר מספיק בלחץ ברומטרי קבוע, עד שהוא מגיע למצב של רוויה, בה הלחות היחסית שווה ל-100%. טמפרטורה זו היא פונקציה של הלחות האבסולוטית ומשקל המים המתאדים ליחידת נפח אוויר (או גז אחר).
Hygrometer: מכשיר המאפשר למדוד את הלחות היחסית שבאוויר.

Dew point hygrometer נקרא גם condensation type hygrometer. המכשיר מורכב ממעין מראה הבנויה ממתכת מבריקה ועוברת תהליך של קירור עד אשר מצטבר עליה טל. הטמפרטורות שבין היווצרות הטל והופעתו על המראה לבין היעלמותו, מייצגות את ה-dew point ונקראות באמצעות שיטות אופטיות – חשמליות. על מנת לקבל מקסימום של דיוק, ישנם תאים פוטואלקטריים אשר מציינים את הזמן שבו המראה מתחילה להתכסות בטל.

תמונה זו מציגה דגם מסוים של המכשיר Dew point hygrometer, אך לא את הדגם המסוים בו השתמשו במאמר – Hygro M4 (לא נמצאה תמונה מייצגת ברשת)

מקורות

מידע כללי

Differential infrared gas analyzer-IRGA
מכשיר ה-IRGA מאפשר לעקוב אחר שינויים בקצב הפוטוסינתזה על-ידי מדידת ריכוז CO2 ואדי המים שבאוויר, הנמצא בתא המדידה והשוואת הערכים לריכוז הגזים באוויר מחוץ לתא. ריכוזים אלו משתנים בתא המדידה, עקב התרחשות תהליכי נשימה, טרנספירציה ופוטוסינתזה.
המכשיר כולל יחידת בקרה המזרימה אוויר בלחץ ובהרכב קבועים. זרם האוויר מתפצל לשניים ומגיע ליחידת המדידה שכוללת שני ספקטרומטרים של אור בתחום ה- I.R (אינפרה אדום). ספקטרומטרים אלה מודדים את ריכוז הגזים באוויר כל הזמן, לפי מידת הבליעה של קרינת ה- I.R בגז הזורם דרכם. ספקטרומטר אחד מודד את ריכוזי CO2 ואדי מים בתא קטן בו נמצא העלה והשני מודד את אותם הריכוזים אך בתא ריק מקביל. לפי ההפרש בריכוזים בין שני התאים וקצב הזרימה, מחושב קצב חילוף הגזים בין העלה לבין סביבתו (המהווה בסיס לחישוב קצב הפוטוסינתזה).
המכשיר כולל גם מחשב לבקרה ואיסוף נתונים ומקור אור המבוקר גם הוא על-ידי אותו מחשב. מקור האור כולל אור כחול ואדום בלבד מהסיבה שאלו אורכי הגל הנקלטים על-ידי הכלורופילים וכן מאחר ואור מלא עלול לגרום לחימום יתר של משטח העלה הנבדק.
התוצאות עבור המדידה שערך המכשיר מתקבלות מיידית ומוצגות ביחידות µmol CO2 m^-2s^-1.
ל-IRGA יש יתרונות וחסרונות. הוא מאפשר לבדוק צמחים בסביבתם הטבעית ולכן אין צורך להביאם למעבדה. יחד עם זאת לא ניתן לבצע בעזרתו מדידות עבור צמחים שבית גידולם הוא מימי ולכן עבור צמחים אלו יש להשתמש בשיטות אחרות. חיסרון נוסף הוא שהמדידה לא מתבצעת על כל פני שטח העלה אלא רק בחלק קטן ממנו ולכן הסקת המסקנות לא בהכרח מהימנה. בנוסף, מאחר והערכים אותם מציג המכשיר מתחשבים תהליך הנשימה, הוא מאפשר למדוד את ה-net photosynthesis, המייצג את קצב הפוטוסינתזה (קצב ה-uptake של CO2, ביחידות של מול לשטח וליחידת זמן).

במאמר השתמשו ב-IRGA מחברת ADC ומדגם 225 MK 3. דגם זה כבר לא מיוצר כיום על ידי החברה, והיא פיתחה דגם חדיש יותר: ADC2250.
ראה מסמך המתאר פירוט על הדגם החדש.

מקורות

חוברת מעבדה בפיזיולוגיה של הצמח, שנה ב
מידע נוסף - דגם ADC2250


Flame atomic absorption spectrophotometer
מכשיר זה מורכב ממקור אור, מערכת בעירה (combustion system), מונוכרומטור, detector (אשר מודד את הקרינה האלקטרומגנטית) ומערכת אלקטרונית אשר פולטת מידע. המכשיר מתבסס על העובדות לפיהן כל האטומים בולעים קרינה אלקטרומגנטית ולכל אלמנט כימי יש אורכי גל ספציפיים בהם הוא פולט או בולע קרינה אלקטרומגנטית.
באמצעות המכשיר ניתן לאמוד את הריכוז של אלמנט מסוים בתמיסה (במאמר נאמד ריכוז המתכת קדמיום), על סמך המדידה של הבליעה של אטומי האלמנט, בזמן בו התמיסה מחוממת ועוברת בתוך להבה. החימום גורם לתהליך אטומיזציה שבמהלכו התמיסה מתחממת, מתאדה, חימום נוסף גורם לתמיסה להתפרק לתרכובות ולבסוף להתפרק לאטומים. האטומים של האלמנט במצב הגזי בולעים קרינה אלקטרומגנטית, אשר נפלטת ממקור האור. מתוך ערכי הבליעה המתקבלים מהמכשיר, ניתן להסיק על ריכוז האלמנט באמצעות עקומת כיול שמבטאת את עוצמת הבליעה כתלות בריכוז האלמנט, בתמיסות סטנדרטיות שונות. במאמר השתמשו במכשיר ממודל 4100, מחברת Perkin Elmer.

מקורות

The Theory and Instrumentation of the Atomic Absorption Spectrophotometer
Perkin Elmer 4100 Atomic Absorption Spectrometer (תמונה של המכשיר)

National Instruments Labview
Labview היא תוכנה המאפשרת לערוך ניסויים, מדידות ולשלוט במערכות.
התוכנה מאפשרת קבלת נתונים ממכשירים, שליטה על מכשירים, ניתוח ואנליזה של נתונים ועוד. התוכנה קיימת למעלה מ-20 שנה ומאפשרת לחוקרים לעבוד ביעילות רבה ולהציג הנתונים באיכות מרבית.

מקורות

קישור לאתר החברה ואינפורמציה נוספת על תוכנה

Pulse amplitude modulation fluorometer
Pulse amplitude modulation fluorometer, או בקיצור PAM fluorometer, הוא מתקן המאפשר למדוד את פלורסנצית הכלורופיל ברקע של עוצמות אור שונות ולתרגם אותה ליעילות קוונטית, אשר ממנה ניתן לחשב באמצעות נוסחא את קצב מעבר האלקטרונים בתהליך הפוטוסינתזה.
כאשר פוטון נקלט על ידי מולקולת כלורופיל, הוא גורם לאקסיטציה של אחד האלקטרונים, אשר נזרק לקליפה החיצונית ובדרך חזרה פולט אנרגיה. האנרגיה שצבר האלקטרון יכולה לקיים פוטוסינתזה, להיפלט כחום או כפלורסנציה. במידה והאנרגיה גורמת לפלורסנציה, האנרגיה נפלטת בצורה של אור בתהליך של דה אקסיטציה, באורך גל שבתחום האדום כהה.
מאחר והפוטוסינתזה מהווה מטרה של הצמח, מרבית האנרגיה מנותבת לקיומה, פחות מ-1% מהאנרגיה שצבר האלקטרון נפלט כחום ו כ 1-5% נפלט כפלורסנציה. לפיכך, עוצמת הפלורסנציה נמצאת ביחס הפוך ליעילות הפוטוסינתזה, כלומר, ככל שיותר אנרגיה מנוצלת לפוטוסינתזה, כך פחות אנרגיה תיפלט כפלורסנציה.
המדידה נעשית באמצעות קירוב של סיב אופטי אל הצמח. ה - PAM fluorometer מכיל אור אדום המאיר כל 10 שניות בעוצמה שונה על דגימת עלה. עוצמת האור מבטאת את שטף הפוטונים הנפלטים לעבר הצמח ומבוטאת ביחידות של µmol photons/m² x s. לפיכך, כל 10 שניות נמדדת היעילות הקוונטית (quantum yield, Y) בהתאם לעוצמת האור וזאת על סמך הפלורסנציה.
היעילות הקוונטית מבטאת את כמות האלקטרונים שעוברים דרך מערכת אור 2, פר פוטון הנבלע על ידי פיגמנטי המערכת הפוטוסינטטית. טווח היעילות הקוונטית נע בין 0 ל-1, כאשר 1 מייצג את הערך התיאורטי המקסימאלי של היעילות הקוונטית ולפיה מול אחד של אלקטרונים עובר דרך מערכת אור 2 פר מול פוטון שנבלע על ידי אותה המערכת.
במצב של עוצמת אור חלשה המכשיר מודד את הפלורסנציה ומתקבל ערך F, המייצג את הפלורסנציה הבסיסית המינימאלית. לאחר מכן המכשיר נותן פולס חזק של אור מרווה, אשר סוגר את כל מרכזי הריאקציה בחלק הנמדד. כתוצאה מכך, כל האנרגיה משתחררת בצורת פלורסנציה שנמדדת כערך 'Fm , הוא ערך הפלורסנציה המקסימאלי. היחס בין 'Fm ל F בנוסחא: 'Fm'-F)/Fm) מבטא את היעילות הקוונטית, ביחידות µmol electron/µmol photons. בהמשך מחושבת הפלורוסנציה במצב של steady state ומתקבל ערך F ושוב נעשה החישוב באמצעות אותה הנוסחא.
מתוך היעילות הקוונטית ניתן לחשב את קצב מעבר האלקטרונים בפוטוסינתזה (ETR), כתלות בעוצמת האור, ביחידות של µmol electron/m²s. החישוב נעשה לפי הכפלת היעילות הקוונטית, אותה מודד המכשיר, בעוצמת האור המשתנה במהלך הניסוי. מאחר ואין התחשבות בנשימה הערכים המתקבלים מייצגים את ה- Gross photosynthesis (בניגוד ל-Net photosynthesis). מאותה הסיבה לא ניתן לחשב את קצב גידול הצמח.
המדידה באמצעות המכשיר היא מהירה ופשוטה ואין צורך לגעת בצמח אלא רק לקרב את הסיב האופטי אל הצמח ולקבל מדדים. בנוסף, המכשיר נייד וקל כך שאפשר לבצע בעזרתו מדידות שדה בסביבתם הטבעית של הצמחים בין אם יבשתית או אקווטית.
הערכים עבור היעילות הקוונטית וקצב מעבר האלקטרונים מוצגים על גבי מסך המכשיר במהלך המדידה.

במאמר השתמשו במכשיר מחברת Walz ומדגם PAM-2000. הדגם כבר לא מיוצר על ידי החברה, אלא, מיוצר דגם מתקדם יותר PAM-2100, כפי שנראה בתמונה.

מקורות

אתר החברה
חוברת מעבדה בפיזיולוגיה של הצמח, שנה ב'

Baryla, A., Carrier, P., FranckF., Coulomb, C., Sahut, C. and Havaux, M. (2001) Leaf chlorosis in oilseed rape plants grown on cadmium-polluted soil: causes and consequences for photosynthesis and prowth. planta, 212, 696-709

Quantum meter
מכשיר ה-Quantum meter מודד את אנרגית האור באורכי גל ספציפיים המנוצלים על ידי צמחים לטובת קיום תהליך הפוטוסינתזה. על סמך מחקרים, מכשירים אחרים כמו lux meter, או, foot-candle meter, הציגו טעויות של עד 45% כאשר השתמשו בהם לאותה מטרה.
המכשיר מודד את שטף הפוטונים (Photosynthetic Photon Flux (PPF ביחידות של µmol m^-2 s^-1, עבור Photosynthetically Active Radiation בטווח אורכי גל של nm 400-700. ניתן להשתמש במכשיר בשדה, במעבדה, בחממות ומעל או מתחת לצמחים.

בתמונה, Quantum meter בסיסי. במאמר השתמשו בQuantum meter מחברת LI-cor ומדגם LI-185A.

מקורות

אתר החברה
Quantum Light Meter

Thermistor probe
Thermistor הינו קיצור של: temperature sensitive resistor, כלומר נגד הרגיש לטמפרטורות. כאשר עובר זרם חשמלי בנגד, נוצר על פניו מפל מתח והאנרגיה החשמלית מומרת לאנרגיה תרמית – חום. Thermistor בנוי מחומר חצי מוליך, עם התנגדות חשמלית בעלת רגישות יתר לטמפרטורה.
במהלך המדידה, ערכי ההתנגדות, הנמדדים על ידי המכשיר ביחידות של אוהם , משתנים כתלות בטמפרטורה באופן שאינו ליניארי. הטמפרטורה נמדדת על סמך ערכים אלו ובאמצעות נוסחא המבטאת את שני הפרמטרים:
a + b(lnR) + c(lnR)³ = 1/T

הנוסחא נקראת - Steinhart Hart equation, כאשר:
- R כאמור נמדד ביחידות של אוהם
- הפרמטרים a,b,c, נקראים Steinhart-Hart parameters וצריכים להינתן עבור המכשיר כחלק מהכיול שלו
- ערכי הטמפרטורה המתקבלים מן המשוואה הם ביחידות קלווין (K)
היתרון במדידת הטמפרטורה באמצעות Thermistor, נובעת מהיותו זול, קטן בגודלו, אמין ומגיב במהירות.

Thermistor probe

מקורות

אתר החברה
Temperature Sensor - The Thermistor

בחזרה לראשית

פירוש מונחים שונים
ABA
EGTA
HEPES
Hoagland's Nutrient Solution
Patch clamp
Perlite
Phytotron
RWC – Relative water content
SEM – standard error of the mean
Sorbitol
מעכבי תעלות סידן
פיוניות - מאפיינים ומנגנון הפתיחה והסגירה
רצועות אפידרמאליות - ההכנה והשיטה

ABA
ABA (חומצה אבציסית), זוהה ואופיין לראשונה ב-1963 על ידי Frederick Addicott ועוזרי המחקר שלו, אשר חקרו את התרכובות האחראיות לנשירת פירות. במקביל למחקר זה, שתי קבוצות אפיינו את התרכובת באופן בלתי תלוי, כאשר אחת מהקבוצות חקרה את התרדמה בניצנים.
ABA הוא אחד ההורמונים הצמחיים, האחראים לגידול ולהתפתחות הצמח. להורמון תפקידי מפתח בנביטה, באמבריוגנזה, בויסות הטרנספירציה ובמצבי עקה. ההורמון מעכב את הגדילה, מעודד תרדמה בניצנים ובזרעים, מעודד סינתזה של חלבוני תשמורת בזרע, מגביר עמידות לקור ומשתתף בבקרה על סגירת פיוניות בעת עקת מים. ההורמון ידוע בשם 'הורמון מצוקה', מאחר והוא מסונתז בתגובה למצבי עקה רבים כמו: עקת חום, עקת מים, עקת קור, מחסור בנוטריינטים ופציעה, ברקמות העלה, גבעול,בשורש ופירות ירוקים.
ההורמון בנוי מתרכובת יחידה בת 15 פחמנים ומסונתז מחומצה מוואלונית (mevalonic acid), בת ה-6 פחמנים. אחר שסונתז, ההורמון יכול לנוע בתוך העלה וכן לעבור מהשורש לעלה באמצעות זרם הטרנספירציה בעיקר דרך העצה (אך יתכן מעבר של ההורמון גם דרך השיפה).

מאפיינים כלליים של ABA:

שם כימי	S-(Z,E)]-5-(1-Hydroxy-2,6,6-trimethyl-4-oxo-2-cyclohexen-1-yl)-3-methyl-2,4-pentanedienoic acid]
נוסחא כימית	C15H20O4
מסה מולקולארית g/mol	264.32
טמפרטורת התכה	161-163°C
טמפרטורת רתיחה	120°C

ABA structure

מקורות

מידע כללי 1
מידע כללי 2
plant-hormones
איור של המסלול שבו ABA מעודד את סגירת הפיוניות

EGTA
EGTA הוא התרכובת הכימית Ethylene Glycol Tetra Acetic Acid שנוסחתה C14:H24:N2:O10.
EGTA הוא בעל תכונות של קלטור, הקרוב מבחינת תכונותיו ל-EDTA, אך בעל אפיניות גבוהה יותר לסידן מאשר ליוני מגנזיום. תרכובת זו מנוצלת בדרך כלל בתמיסות בופר המחקות את הסביבה הפנימית של תאים חיים.

מקורות

מידע כללי

HEPES
HEPES הוא בופר אורגאני, אשר נראה כאבקה גבישית לבנה. הנוסחא הכימית שלו היא C8:H18:N2:O4:S. והשם הכימי שלו הוא: 4-2-hydroxyethyl-1-piperazineethanesulfonic acid. לרוב משתמשים בו בתרבית תאים על מנת לשמור על pH פיזיולוגי וכן על מנת לשמור מפני קיפאון של תמיסות המכילות אינזימים.

מקורות

מידע מתוך אתר החברה
מידע כללי


Hoagland's Nutrient Solution
הידרופוניקה היא שיטה לגידול צמחים ללא קרקע, כשהם ניזונים מתמיסה של היסודות הדרושים ב-PH המתאים, תוך בקרה מתמדת על הרכב המינראלים שלה.
Hoagland's Nutrient Solution, היא תמיסת נוטריינטים אשר פותחה על ידי הפיזיולוג Dennis R. Hoagland, לטובת הידרופוניקה של צמחי עגבניות. כיום, היא מנוצלת על ידי חוקרים ומחקרים רבים בכל העולם לטובת גידול צמחים רבים.
התמיסה כוללת מאקרונוטריינטים, כמו: סידן, ניטראט, אשלגן, מגנזיום, פוספאט וכן מיקרונוטריינטים, אך בכמויות קטנות יותר, כמו: מנגן, נחושת, ברזל. כלל הנוטריינטים חיוניים למהלך התפתחות וגידול תקין של הצמח.

מקורות

מידע כללי
Hydroponics

Patch clamp
שיטה זו פותחה על ידי צמח המדעניםErwin Neher ו-Bert Sakmann בסוף שנות ה-70 ותחילת שנות ה-80, שקיבלו על כך נובל בתחום הפיזיולוגיה או הרפואה.
השיטה מאפשרת ללמוד על מעבר המומסים דרך תעלת יונים מסוימת, באמצעות אנליזה חשמלית של חלק קטן מהממברנה. בצמחים, החלק לא מכיל דופן ומהווה פרוטופלסט או טונופלסט ערומים.
השיטה הבסיסית כוללת שימוש באלקטרודת זכוכית הנקראת micropipette, כשקוטר הקצה שלה הוא בגודל של 1 מיקרומטר. קצה האלקטרודה איננו חד, אלא, חלק ובצורה של חצי מעגל. אל פנים האלקטרודת זכוכית מוספת תמיסה מימית אשר מחקה את הנוזל החוץ תאי. כאשר מפעילים לחץ יניקה על פנים האלקטרודה , ממברנת התא נשאבת אל תוך קצה האלקטרודה וחלק קטן ממנה נשאר צמוד אליה. מהצד השני של האלקטרודה מוכנסת אלקטרודת מתכת, אשר נמצאת במגע עם התמיסה. כאשר יש מעבר של זרם מהתעלה היונית לאלקטרודה, הוא עובר דרך האלקטרודת מתכת ישירות לעבר voltage clamp amplifier, אשר מקליט את השינויים החשמליים ומאפשר את התצוגה שלהם.
כך מעבר האלקטרונים דרך תעלת יונים בודדה יכול להיבחן ולהיות מוקלט בין הציטופלסמה של התא לתמיסה הממלאת את האלקטרודה. על סמך ההקלטה ניתן להסיק על אופן הפתיחה והסגירה של התעלות כתלות בזמן. כמו כן, ניתן לשנות את תכולת התמיסה המוספת לאלקטרודה ולהוסיף לה מרכיבים שונים, במטרה לבדוק את התנהגות התעלה היונית במצבים שונים.

Whole cell patch
קיימות מספר וריאציות לשיטה הבסיסית אשר יכולות להיות מיושמות וזאת כתלות במטרת המחקר של החוקר. להלן תיאור של כמה מהן:

Inside out patch
האלקטרודה נמשכת חזרה מהתא ובכך קורעת ממנו את מקטע הממברנה, המחובר כעת לאלקטרודה. החלק התוך תאי של הממברנה חשוף למדיום. וריאציה זו של השיטה מאפשרת לבדוק את השפעת הסביבה על פנים התעלה היונית.
Outside out patch
האלקטרודה יוצאת מהתא בצורה איטית המאפשרת יצירה של שלפוחית ממברנה. כאשר האלקטרודה מרוחקת מספיק מהתא, בקצה נמצאת שלפוחית הממברנה בצורה של כדור, כאשר הקצה החיצוני שלה הוא פני שטח הכדור. וריאציה זו של השיטה מאפשרת לבדוק את תכונות התעלה היונית כאשר היא מוגנת מהסביבה ולא במגע איתה.
Whole cell recording - whole cell patch
האלקטרודה נשארת במקומה, אך מופעל הרבה יותר לחץ שאיבה, לטובת כליאת החלק של הממברנה, אשר נמצא בתוך האלקטרודה. כתוצאה מכך יש גישה למרווח התוך תאי. היתרון בשיטה זו הוא שקצה האלקטרודה רחב יותר ולכן מספר פחות התנגדות, מה שגורם לגישה טובה יותר לפנים התא. החיסרון בשיטה הוא שנפח האלקטרודה גדול יותר מנפח התא ולכן התמיסה התוך תאית מתחלפת בתכולת האלקטרודה.
עקב כך, תכונות התא אשר תלויות בתמיסה התוך תאית משתנות. באמצעות וריאציה זו ניתן להקליט זרמים במספר תעלות בו זמנית. זוהי הוריאציה שבה השתמשו במאמר.

מקורות

מידע כללי
עקרונות השיטה
אוסף תמונות של ה-Recording equipment
תמונות עבור כל וריאציה
סרטון המציג את השיטה

Alberts, B., Bray, D., Hopkin, K., Johnson, A., Raff, M., Lewis, J., Walter, P., Roberts, K. (2004) essential cell biology (Abingdon, New York),2nd ed, pp 403-407

Perlite
perlite הוא חומר העשוי מזכוכית אמורפית ובעל תכולה גבוה של מים. הוא מופיע באופן טבעי עקב פעילות וולקנית ובעת חשיפה לטמפרטורה גבוהה הוא מתרחב בצורה משמעותית. בטווח טמפרטורות של 850-900 מעלות מתרכך, המים שהיו כלואים בו מתאדים וכתוצאה מכך החומר מתרחב פי 7-15 מנפחו המקורי. צבע החומר בעת היותו רחב הוא לבן מבריק, הודות להשתקפות הבועות הכלואות.
ל-perlite יש שימושיים מסחריים רבים, הודות למחיר הנמוך ולצפיפות הנמוכה שלו. בחקלאות ובגינון, הוא גורם לזבל אורגאני להיות פתוח יותר לאוויר במקביל ליכולתו לאחוז במים. כמו כן, הוא מהווה מדיום טוב בעת טיפוח צמחים בתמיסה מימית של נוטריינטים (הידרופוניקה).

perlite

מקורות

מידע כללי

Phytotron
ה-phytotron הוא מתקן לחקר תגובותיהם של צמחים למגוון תנאי הסביבה. המתקן מאפשר גידול בו זמני של צמחים בכמה שילובים של תנאי סביבה מבוקרים, כמו: אורך יום, עוצמת הארה, טמפרטורת יום ולילה, לחות אוויר ביום ובלילה, אספקת מים ומינראלים וטיב האוויר.
בדרך זו ניתן לבודד השפעתו של כל גורם וכן לבדוק השפעות משולבות של גורמים מסוימים על גידול הצמחים. אחידות גבוהה של תנאי הסביבה מאפשרת הקטנה משמעותית של המדגם הנבדק.

מקורות

קולר, ד. (2002). מדריך אנציקלופדי למדעי הצמח. עמ' 167

RWC – Relative water content
RWC מהווה אינדיקאטור למאזן המים בצמח, מאחר והוא מבטא את היחס בין כמות המים בזמן נתון וברקמה מסוימת לבין כמות המים המקסימאלית שיכולה להתקבל במצב של טורגור מלא (Slatyer 1967). ערכים נורמאליים של RWC נעים בין 98% במצב של טורגור מלא ל40% במצב של מחסור במים. המדידה נעשית לרוב ברקמת העלה.

חישוב הפרמטר מתבצע לפי הנוסחא הבאה:
(RWC = (FW-DW)/(TW-DW
FW = fresh weight, משקל טרי של הרקמה
DW = dry weight, משקל יבש של הרקמה לאחר שמועברת לתנור בטמפרטורה גבוהה
TW = turgid weight, משקל הרקמה במצב של לחץ טורגור מלא לאחר שמצוייה בתמיסה היפוטונית למשך מספר שעות
על מנת לקבל את הערכים באחוזים מכפילים ב-100 את הערך המתקבל מהנוסחא.

מקורות

Leaf relative water content

Slatyer, R.O (1967). Plant-water relationships. Academic Press. New York,336

SEM – standard error of the mean
SEM הוא פרמטר סטטיסטי שמחושב על ידי חלוקת סטיית התקן (SD) של הדוגמא, המחושבת מתוך פיזור ערכי המדידות שלה, בשורש של גודל המדגם (n). מקובל להשתמש בגודל מדגם הגבוה מ-30. הערך נותן לנו מושג עד כמה ממוצע הדגימה קרוב לממוצע האמיתי של אוכלוסיית המדגם. ככל שאוכלוסיית המדגם גדולה יותר, ערך SEM הולך ונעשה קטן יותר.

מקורות

הסבר הפרמטר וחישובו 1
הסבר הפרמטר וחישובו 2

Sorbitol
סורביטול הוא אלכוהול גבישי מתוק הקרוי גם glucitol. הוא מיוצר באופן טבעי בגופנו, באופן מלאכותי וקיים בפירות וירקות שונים. עקב ערך קלורי מועט ביחס לסוכר ועמילן משמש בתחליף לסוכר בדיאטה. עיכול הסורביטול מאוד איטי ועודף שלו בתאים יכול לגרום לנזק כמו: כאבי בטן, שלשולים, פגיעה בעיניים ופגיעה בספיגת פרוקטוז.
הנוסחא הכימית שלו היא C6:H8:O6:H6.
הסורביטול הוא איזומר של מניטול. לשניהם יש את אותה נוסחא הכימית, אך המבנה שלהם שונה. ניתן לאפיין את סורביטול מבחינה מבנית, כמולקולת גלוקוז בתוספת של שני מימנים, במקום בו היה בגלוקוז קשר כפול בין פחמן לחמצן.
במאמר השתמשו בסורביטול מתוך מטרה להעלות את האוסמולאליות של התמיסה. האוסמולאליות מבטאת את מספר החלקיקים המומסים (ביחידות של מול) ליחידת מסה של התמיסה. מכאן שהיחידות של אוסמולאליות הן mmol/kg.

מקורות

מידע כללי

מעכבי תעלות סידן
לתעלות הסידן, כמו תעלות תלויות מתח אחרות, יש 3 מצבים: מצב מנוחה (rest state) המיוצב בפוטנציאל שלילי, מצב שבו התעלה פתוחה (open state) ומאוקטב על ידי דה פולריזציה ומצב של אינאקטיבציה (inactivate state) בו התעלה נסגרת. ממצב המנוחה התעלה נפתחת כתוצאה מדה פולריזציה בהמשך נסגרת למצב אינאקטיבי. כעת התעלה חוזרת למצב המנוחה ממנו היא יכולה שוב להיפתח.
מעכבי תעלות סידן מעכבים את שטף יוני הסידן פנימה במהלך דה פולריזציה, על ידי ייצוב אלוסטרי של המצב האינאקטיבי, בו התעלה סגורה. כתוצאה מכך, החזרה למצב המנוחה מעוכב ולכן התעלה לא נפתחת מחדש.
מאחר וסידן מהווה שליח משני המשפיע על תהליכים ביולוגיים שונים, מחסור שלו בתאים צמחים ואנימאליים גורר נזקים רבים.
קיימים 3 סוגים של מעכבים אורגאניים כימיים. למרות השוני המבני בין שלושת סוגים אלו, כולם נקשרים לאתר קישור יחיד הקרוב לפתח התעלה. בשלושתם משתמשים כאמצעי תרופתי בבני אדם, כטיפול ללחץ דם גבוה ובעיות הקשורות ללב.
1. Dihydropyridines – דיהידרופירידינים, אליהם משתייך המעכב nifedipine בו השתמשו במאמר
2. phenylalkylamines – פנילאלקילאמינים, אליהם משתייך המעכב verapamil בו השתמשו במאמר
3. benzothiazepines – בנזוטיאזפינים

פרט לסוגים אלו, קיימים מעכבים נוספים לתעלות סידן, ביניהם Sulfadiazine ו- La⁺³, אשר מנגנון העיכוב שלהם פחות מוכר.

להלן מאפיינים כלליים של ארבעת המעכבים בהם נעשה שימוש במאמר:

Nifedipine
Nifedipine הוא דיהידרופירידין, בעל הנוסחא הכימית C17:H18:N2:O6. חומר זה נחשב כמעכב של תעלות סידן, כפי שנצפה בתרחיף של צמח העגבנייה, בתאי רקמת שורש סלק ובתאי הסגירה של V.faba. המשקל המולקולארי של החומר הוא 346.337 g/mol.
מעכב זה מייצב את המצב האינאקטיבי של התעלה ולא מצריך את פתיחת התעלה לצורך העיכוב.

Nifedipine

Verapamil
Verapamil הוא פנילאלקילאמין בעל הנוסחא הכימית C27:H38:N2:O4. חומר זה נחשב כמעכב של תעלות סידן, כפי שנצפה בתאי רקמת השורש של חיטה, שיפון וסלק. המשקל המולקולארי של החומר הוא g/mol 454.602 .

מעכב זה יכול להיקשר לתעלה רק במצב שבו היא פתוחה (open state), כאשר הוא מפריע ליוני הסידן להיקשר לחלק החוץ תאי של פתח התעלה. כתוצאה מעיכוב כניסת יוני הסידן התעלה נכנסת למצב האינאקטיבי. בנוסף, המעכב גורם גם להארכת התקופה הרפרקטורית כתוצאה מהאטת החזרה של התעלה למצב המנוחה.

SDZ - Sulfadiazine
Sulfadiazine הוא סולפונאמיד, בעל הנוסחא הכימית C10:H10:N4:O2:S, המעכב את תעלות הסידן. המשקל המולקולארי של החומר הוא 358.146 g/mol.
פרט להיותו מעכב של תעלות סידן, הוא גם מפסיק את יצור החומצה הפולית בתא החיידק ובכך גורם למותו וכן ניתן כטיפול לזיהומים בשתן.

SDZ

Lanthanum
Lanthanum הוא אלמנט מתכתי לבן, שסימנו בטבלה המחזורית הוא La ומספרו האטומי הוא 57. המשקל המולקולארי שלו הוא amu 138.9055 מתכת זו היא ריאקטיבית מאוד ומגיבה ישירות עם אלמנטים כמו סיליקון, הלוגן, פחמן, נתרן ובורון. בחשיפה לחמצן המתכת מתחמצנת במהירות.
למתכת אין תפקיד ביולוגי ידוע, אך אופיינה כבעלת תכונות של עיכוב תעלות סידן בתאי השמירה של הצמחים:A.thaliana ו-V.faba, כאשר היא טעונה במטען חיובי +3 (Hemilton et al., 2000 ) וכן בתאי רקמת שורש חיטה, סלק ושיפון, תאי רקמת אפידרמיס פקעת הבצל ותרחיף של צמח העגבנייה

מקורות

מידע כללי

Hamilton, D.W.A., Hills, A., Kohler, B. and Blatt, M.R. (2000) Ca2+ channels at the plasma membrane of stomatal guard cells are activated by hyperpolarization and abscisic acid. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 97, 4967–4972

White, P. (2000) Calcium channels in higher plants. BBA Acta, 1465, 171–189

פיוניות - מאפיינים ומנגנון הפתיחה והסגירה
הפיוניות הן חורים מיקרוסקופיים שנמצאים על פני השטח העלה, בריקמה האפידרמאלית. הדו פסיגים מכילים יותר פיוניות בצד התחתון של העלה מאשר בצד העליון, מכיוון שהעלים בקבוצה זו מוצגים בצורה אופקית ובכך יש סיוע בצמצום אובדן המים. לחד פסיגים לעומת זאת, יש מספר דומה של פיוניות בשני הצדדים מאחר שהעלים בקבוצה זו מוצגים באופן ורטיקלי.
תפקידם הוא לאפשר חילוף של גזים בין האטמוספרה לפנים העלה. פחמן דו חמצני וחמצן נכנסים דרך הפיוניות לצמח ומנוצלים בתהליכי הפוטוסינתזה והנשימה. עודף חמצן המיוצר בפוטוסינתזה יוצא גם כן דרכן. בנוסף, דרך הפיוניות משוחררים אדי מים לאטמוספרה בתהליך הטרנספירציה.
נקב הפיונית תחום על ידי שני תאים אפידרמליים, הנקראים תאים שומרים (=guard cells) או תאי סגירה. דופן תא הסגירה בחלק הקרוב לנקב הפיונית, עבה יותר משאר חלקי הדופן ולכן הוא פחות גמיש. שינוי בגודל וצורת התאים גורם לסגירה או לפתיחה של הפיונית.
כאשר השורשים חשים במחסור של מים באדמה, ההורמון ABA משוחרר ונקשר לרצפטורים מסוימים שנמצאים בממברנה הפלסמטית של תאי השמירה. הקישור גורם להפעלת תעלות סידן שנמצאות גם כן בממברנה הפלסמטית, כך שיוני סידן נכנסים לתוך הציטוזול. בציטוזול, מתפקד יון הסידן כשליח משני אשר גורם לפתיחת תעלות אניוניות, המאפשרות את מעבר יוני הכלור ויוני מלאט מהציטוזול לעבר דופן התאים. התוצאה היא ירידה בפוטנציאל החשמלי סביב הממברנה הפלסמטית, דבר הגורם לפתיחת תעלות אשלגן המאפשרות את שחרור היונים לעבר דופן התאים. מעבר המומסים מהציטוזול לעבר הדופן גורם לירידה בלחץ הטורגור בתאי השמירה ובכך גם לסירת נקב הפיונית. לאחר שההורמון ABA מוסר, תאי השמירה מכניסים בחזרה את יוני האשלגן והכלור אל תוך התא, תוך שימוש בגרדיאנט אלקטרוכימי שמיוצר על ידי משאבת הפרוטונים שבממברנה הפלסמטית. הפוטנציאל האוסמוטי בתאי השמירה הופך לשלילי וגורם לכניסה של מים אל תוך התאים באמצעות אוסמוזה, כך שלחץ הטורגור עולה והתוצאה היא פתיחה של נקב הפיונית, דרכו יכולים לנוע גזים.
ABA הוא סיגנל אנדוגני המשפיע על הפתיחה והסגירה של הפיונית, אך קיימים סיגנלים אנדוגנים אחרים וסיגנלים סביבתיים נוספים, אשר מווסתים את תכולת המים ולחץ הטורגור בתאי השמירה.
במצב של מחסור במים, הפיונית סגורה ולכן קצב הפוטוסינתזה יורד לרמה נמוכה, אך לא נפסק לחלוטין מאחר וקיים ריכוז מסוים של פחמן דו חמצני שנוצר בתהליך הנשימה בצמח.

מקורות

מידע כללי
Mechanism and Regulation of Stomata Movements
מספר סרטים על תאי השמירה של V.faba

רצועות אפידרמאליות - ההכנה והשיטה
Epidermal strip, או, peel, מוגדרת כחתיכה או רצועה של רקמה אפידרמאלית מעלה. השימוש ברצועה אפידרמאלית הינו לקביעה של נוכחות נקבי פיוניות בעלה ואו לבדיקת התגובה של הפיוניות לתנאים שונים בזמן שהם נמצאים במדיום מימי. תגובת נקב הפיונית לטיפולים שונים יכולה להיבדק באמצעות מיקרוסקופ אור פשוט. כמו כן, עריכת הניסוי במספר רב של מדידות תורם לסטטיסטיקה של מהימנות התוצאות.
לשיטה זו של קילוף רצועות אפידרמאליות יש מספר חסרונות. ראשית היא מוגבלת למינים מסוימים ובכך קיים הסיכון שהמחקר יהיה סביב מינים אלו. כמו כן, יש צורך בריכוז ובמיומנות על מנת לפענח את התוצאות מפאת טווח רחב של ארטיפקטים ידועים, שעלולים להשפיע על אמינות התוצאות. יתרה מכך, יש לקחת בחשבון שהתוצאות המתקבלות בניסוי שמשלב רצועה אפידרמאלית הן לאו דווקא משקפות את המתרחש בעלה השלם.

קילוף רצועות אפידרמאליות נעשה כאמור מהעלים. תחילה חותכים רצועות מטרף העלה, על גבי לוח פרספקס (Perspex, חומר פלסטי שקוף), באמצעות סקלפל. החיתוך נעשה לאורך הצינור המרכזי של העלה. באמצעות נייר מילימטר הדבוק ללוח החיתוך מודדים את האורך הרצוי. בהמשך עושים חיתוך נוסף באפידרמיס העליון של קצה אחד של הטרף מבלי לפגוע באפידרמיס התחתון. כעת הופכים את הרקמה ומרימים את החלק בו נעשה החתך לאחור ובפעולת קילוף בזווית של 90°C, מפרידים בין האפידרמיס התחתון לרקמה הספוגית של המזופיל. לאחר הקילוף, הרצועה האפידרמאלית צריכה להיות מועברת במהירות למדיום מתאים, שם היא תחתך לסגמנטים בצורה ובאורך הרצוי. זווית הקילוף צריכה להיות 90°C, על מנת שויאביליות התאים תהיה מקסימאלית ושלא יהיה זיהום של תאים מהרקמה הספוגית.
במאמר, הוכנו רצועות אפידרמאליות בגודל של 5mm x 5mm, מהאפידרמיס התחתון של עלים משלושת מיני הצמחים: A.thaliana, C.communis, V.faba, לאחר שנאספו במהלך הלילה.
בתום הקילוף הועברו הרצועות לתמיסות אינקובציה מתאימות כאשר הצד העליון שלהם הופנה כלפי מעלה.

שיטת קילוף רצועות אפידרמאליות.
שלבים (a) – (d) מתארים את רצף האירועים שתואר לעיל, בו מקולפות רצועות אפידרמאליות מתוך חתיכות עלה.
השיטה כוללת קילוף של הרצועה האפידרמאלית לאחר חתך שנעשה באפידרמיס העליון באמצעות סקלפל
וקילוף האפידרמיס התחתון לאחור, בזווית של 90°C.

מקורות

weyers, J. and Meidner, H. (1990) in Methods in stomatal research (Longman, New york), pp 135-137

תמונות מיקרוסקופיות של רצועות אפידרמאליות מצמחים שונים

בחזרה לראשית

ביבליוגרפיה

Alberts, B., Bray, D., Hopkin, K., Johnson, A., Raff, M., Lewis, J., Walter, P., Roberts, K. (2004) essential cell biology (Abingdon, New York),2nd ed, pp 403-407

Baryla, A., Carrier, P., Franck, F., Coulomb, C., Sahut, C. and Havaux, M. (2001) Leaf chlorosis in oilseed rape plants (Brassica napus) grown on cadmium-polluted soil: causes and consequences for photosynthesis and growth. Planta, 212, 696–709

Bazzaz, F.A., Rolfe, G.L. and Carlson, R.W. (1974) Effect of Cd 2+ on photosynthesis and transpiration in excised leaves of corn and sunflower. Plant Physiol. 32, 373–376

Cheung, W.Y. (1988) Calmodulin and its activation by cadmium ion. Ann. N.Y. Acad. Sci. 522, 74–87

Cohen, C.K., Fox, T.C., Garvin, D.F. and Kochian, L.V. (1998) The role of iron-deficiency stress responses in stimulating heavy-metal transport in plants. Plant Physiol. 116, 1063–1072

Das,p., Samantaray, S., Rout R. (1997) Studies on cadmium toxicity in plants: A review Environmental pollution.98, 29-36

Greger, M. and ogren, E. (1991) Direct and indirect effects of Cd 2+ on photosynthesis in sugar beet (Beta vulgaris). Physiol. Plant. 83, 129–135

Grill, E., Winnacker, E.L. and Zenk, M.H. (1987) Phytochelatins, a class of heavy-metal binding peptides from plants are functionally analogous to methallothioneins. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 84, 439–443

Haag-Kerwer, A., Schafer, H.J., Heiss, S., Walter, C. and Rausch, T. (1999) Cadmium exposure in Brassica juncea causes a decline in transpiration rate and leaf expansion without effect on photosynthesis. J. Exp. Bot. 341, 1827–1835

Hamilton, D.W.A., Hills, A., Kohler, B. and Blatt, M.R. (2000) Ca2+ channels at the plasma membrane of stomatal guard cells are activated by hyperpolarization and abscisic acid. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 97, 4967–4972

Hoth, S., Morgante, M., Sanchez, J.P., Hanafey, M., Tingey, S., and Chua, N.-H. (2002). Genome-wide gene expression profiling in Arabidopsis thaliana reveals new targets of abscisic acid and largely impaired gene regulation in the abi1–1 mutant. J. Cell Sci. 115, 4891–4900

Koornneef, M., Reuling, G. and Karssen, C.M. (1984) The isolation and characterization of abscisic acid-insensitive mutants of Arabidopsis thaliana. Physiol. Plant. 61, 377–383

Korshunova, Y.O., Eide, D., Clark, W.G., Guerinot, M.L. and Pakrasi, H.B. (1999) The IRT1 protein from Arabidopsis thaliana is a metal transporter with a broad substrate range. Plant Mol Biol. 40, 37–44

Lasat, M.M., Pence, N.S., Garvin, D.F., Ebbs, S.D. and Kochian, L.V. (2000) Molecular physiology of zinc transport in the Zn hyperaccumulator Thlaspi caerulescens. J. Exp Bot. 342, 71–79

Leonhardt, N., Marin, E., Vavasseur, A. and Forestier, C. (1997) Evidence for the existence of a sulfonylurea-receptor-like protein in plants: modulation of stomatal movements and guard cell potassium channels by sulfonylureas and potassium channel openers. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 94, 14156–14161

Leonhardt, N., Vavasseur, A. and Forestier, C. (1999) ATP-binding cassette modulators control abscisic acid regulated slow anion channels in guard cells. Plant Cell, 11, 1141–1151

Leymarie, J., Lasceve, G. and Vavasseur, A. (1998) Elevated CO2 enhances stomatal responses to osmotic stress and ABA in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Envir. 22, 301–308

Leymarie, J., Vavasseur, A. and Lasceve, G. (1998) CO2 sensing in stomata of abi1-1 and abi2-1 mutants of Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. Biochem. 36, 539–543

Moran, N., Fox, D. and Satter, R.L. (1990) Interaction of the depolarization-activated K+ channel of Samanea saman with inorganic ions: a patch-clamp study. Plant Physiol. 94, 424–431

Olivi, L. and Bressler, J. (2000) Maitotoxin stimulates Cd 2+ influx in Madin–Darby kidney cells by activating Ca-permeable cation channels. Cell Calcium, 27, 187–193

Pei, Z.M., Murata, Y., Benning, G., Thomine, S., Klusener, B., Allen, G.J., Grill, E. and Schroeder, J.I. (2000) Calcium channels activated by hydrogen peroxide mediate abscisic acid signaling in guard cells. Nature, 406, 731–734

Poschenrieder, C., Gunse, B. and Barcelo, J. (1989) Influence of cadmium on water relations, stomatal resistance and abscisic content in expanding bean leaves. Plant Physiol. 90, 1365–1371

Schulze.E.-D, Beck.E, K.Muller-Hohenstein. (2005) Plant Ecology, pp182-194

Schutzendubel, A., Schanz, P., Teichmann, T., Gross, K., Langenfeld-Heyser, R., Godbold, D. and Polle, A. (2001) Cadmium-induced changes in antioxidative systems, hydrogen peroxide content, and differentiation in scots pine roots. Plant Physiol. 127, 887–898

Slatyer, R.O (1967). Plant-water relationships. Academic Press. New York, 336

Smart, R.E., Bingham, G.E. (1974) Rapid estimates of relative water content. plant physiol. 53, 258-260

Suzuki, Y., Chao, S.H., Zysk, J.R. and Cheung, W.Y. (1985) Stimulation of calmodulin by cadmium ion. Arch. Toxicol. 57, 205–211

Usai, C., Barberis, A., Moccagatta, L. and Marchetti, C. (1999) Pathways of cadmium influx in mammalian neurons. J. Neurochem. 72, 2154–2161

Vavasseur A, Lasceve G, Cousson A (1995) Guard cell responses to potassium ferricyanide Physiol Plant 93: 253-258

Vogeli-Lange, R. and Wagner, G.J. (1990) Subcellular localization of cadmium-binding peptides in tobacco leaves. Implications of a transport function for cadmium-binding peptides. Plant Physiol. 92, 1086–1096

weyers, J. and Meidner, H. (1990) in Methods in stomatal research (Longman, New york), pp 135-137

White, P. (2000) Calcium channels in higher plants. BBA Acta, 1465, 171–189

חוברת מעבדה בפיזיולוגיה של הצמח, שנה ב'

קולר, ד. (2002). מדריך אנציקלופדי למדעי הצמח. עמ' 167

בחזרה לראשית